ivmМеждународный вестник ветеринарииInternational Journal of Veterinary Medicine2072-2419SpbGUVM Publishing House10.52419/issn2072-2419.2023.4.68ivm-1158Research ArticleИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИINFECTIOUS DISEASESМолекулярная характеристика Cryptosporidium scrofarum в свиноводческих хозяйствах Вологодской области Северо-Западного Федерального округа РФMolecular characteristics of Cryptosporidium scrofarum in pig farms of the Vologda region of the Northwestern Federal District of the Russian Federationhttps://orcid.org/0000-0001-7015-8063КряжевА. Л.KryazhevA. L.

д-р ветеринар. наук, проф. кафедры эпизоотологии и микробиологии

Doctor  of  Veterinary Sciences, Professor of Department of Epizootology  and  Microbiology

kamarnett@mail.tuhttps://orcid.org/0000-0002-6919-8524НовиковА. С.NovikovA. S.

канд. ветеринар. наук, доц. кафедры внутренних незаразных болезней, хирургии и акушерства

Candidate of Veterinary Sciences, Associate Professor  of Department  of  Internal  Non-Contagious  Diseases, Surgery  and  Obstetrics, Ph.D 

ФГБОУ ВО Вологодская ГМХА им. Н.В. ВерещагинаРоссияFSBE Institution of Higher Education «Vologda State Dairy Farming Academy named after N.V. Vereshchagin»Russian Federation202310122023046877Copyright © Кряжев А.Л., Новиков А.С., 20232023Кряжев А.Л., Новиков А.С.Kryazhev A.L., Novikov A.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vetjournal.spbguvm.ru/jour/article/view/1158

Криптоспоридиоз – зооноз,  имеющий  глобальное  распространение, вызываемый протистами рода Cryptosporidium. К настоящему времени  с  применением  в  исследованиях  молекулярно-генетических методов идентифицировано 44 вида и 120 генотипов представителей рода Cryptosporidium. У свиней выделено тринадцать различных видов/генотипов с доминированием Cryptosporidium suis и Cryptosporidium scrofarum. В РФ идентификация видов криптоспоридий у поросят при помощи молекулярно-генетических методов ранее не проводилась. Целью данных исследований было выявление, идентификация, анализ и изучение особенностей распространения Cryptosporidium scrofarum у свиней в хозяйствах Вологодской области СЗФО РФ. Впервые в РФ на примере Вологодской области СЗФО в свиноводческих хозяйствах различного типа с применением ранее разработанных, а также в результате собственных  разработок  новейших  молекулярно-генетических  методик,  а  именно –  NGS секвенирования ампликонов фрагментов гена 18S рРНК, полученных в результате проведения вложенной ПЦР, нами установлено паразитирование С. scrofarum у свиней всех возрастных групп. Инвазированность животных, содержащихся в свинокомплексах составила 34%, в фермерских хозяйствах – 32,4%. Наиболее подвержены заражению поросята, находящиеся на откорме в возрасте 13-24 недель. 

Анализ таксономической принадлежности ASV проведённый с помощью филогенетического анализа, дополненного анализом с использованием алгоритма blastn в базе данных GenBank, показал, что суммарно во всех исследованных образцах присутствуют 10 ASV-типов (amplicon sequence variant), имеющих высокое сходство с последовательностями, депонированными в GenBank, как фрагменты гена 18S рРНК Cryptosporidium scrofarum. Установлено, что типы ASV1 и ASV2, выявляемые в различных географических регионах мира от Португалии и Великобритании до Китая, Индии и Австралии, идентифицированы во всех обследуемых хозяйствах, хотя и в существенно различных количествах. Остальные ASV присутствуют в значительно меньшем количестве и не повторяются от хозяйства к хозяйству. Вероятно, эти последовательности принадлежат местным популяциям  подвидов Cryptosporidium  scrofarum. Интересным  представляется  обнаружение уникальной  последовательности  рода Cryptosporidium типа  ASV8, который  в  последствии может быть описан как новый вид.  

Обнаруженные нами нуклеотидные последовательности являются уникальными. Каждая из них была депонирована в GenBank c присвоением идентификаторов (Sequence ID: OR649139,  OR654022,  OR654023,  OR661243,  OR661244,  OR654051,  OR654052, OR654083, OR654084, OR654106).

The purpose of these studies was to identify, identify, analyze and study the distribution of Cryptosporidium scrofarum in pigs in the  farms  of  the  Vologda  Region  of  the Northwestern Federal District of the Russian Federation.

For the first time in the Russian Federation, using the example of the Vologda Oblast of the Northwestern Federal District in pig  farms  of  various  types  using  the  latest molecular  genetic  methods,  namely  using high-throughput  sequencing  of  amplicon libraries of fragments of the 18S rRNA gene obtained  because  of  nested  PCR,  we  have established the infection of C. scrofarum in all  age  groups  of  examined  animals.  The contamination of animals kept in pig farms was 34%, in farms - 32.4%. Animals that are fattened at the age of 13-24 weeks are most susceptible to infection.

Analysis  of  ASV  taxonomic  affiliation using  phylogenetic  analysis,  supplemented by analysis using the blastn algorithm in the GenBank database, showed that a total of 10 ASV types (amplicon sequence variant) are present  in  all  tested  samples,  which  have high  similarity  to  sequences  deposited  in GenBank  as  fragments  of  the  18S  p  gene Cryptosporidium  scrofarum  RNA.  It  has been established that the types of ASV1 and ASV2  detected  in  various  geographical  regions of the world from Portugal and Great Britain  to  China,  India  and  Australia  are identified in all examined farms, although in significantly  different  quantities.  The  remaining ASVs are present in much smaller numbers  and  do  not  repeat  from  farm  to farm.  These  sequences  probably  belong  to local populations of subspecies Cryptosporidium scrofarum.  It  is  interesting  to  find  a unique sequence of the genus Cryptosporidium  of  type  ASV8,  which  can  later  be  described as a new species.

криптоспоридиозCryptosporidium scrofarumооцистыПЦРДНКсеквенирование18S рРНКпоросятаВологодская областьРоссийская ФедерацияcryptosporidiosisCryptosporidium scrofarumoocystsPCRDNAsequencingASVamplicon sequence variant18S rRNApigletsthe Vologda regionthe Russian FederationИсследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-26-00002, https://rscf.ru/project/22-26-00002/. Молекулярно-генетические исследования выполнены с использованием оборудования с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ФГБНУ ВНИИСХМThe study was carried out at the expense of a grant from the Russian Science Foundation No. 22-26-00002, https://rscf.ru/project/22-26-00002/. The study was carried out using the equipment of the resource center «Genomic Technologies, Proteomics and Cell Biology» of ARRIAM.ReferencesSnelling, W. J. Cryptosporidiosis in developing countries / W. J. Snelling, L. Xiao, G. Ortega-Pierres, C. J. Lowery, J. E. Moore, J. R. Rao, & J. S. Dooley // The Journal of Infection in Developing Countries. – 2007. – Vol. 1(03). – P. 242-256. – DOI 10.3855/jidc.360Snelling WJ, Xiao L, Ortega-Pierres G, Lowery CJ, Moore JE, Rao JR, Dooley JS. Cryptosporidiosis in developing countries. The Journal of Infection in Developing Countries. 2007;1(03):242-256. doi:10.3855/jidc.360Kotloff, K.L. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): a prospective, case-control study / K.L. Kotloff, J.P. Nataro, W.C. Blackwelder, D. Nasrin, T.H. Farag, S. Panchalingam,... & M.M. Levine // The Lancet. – 2013. – Vol. 382 (9888). – P. 209-222. – DOI 10.1016/S0140-6736(13)60844-2Kotloff KL, Nataro JP, Blackwelder WC, Nasrin D, Farag TH, Panchalingam S, Levine MM. Burden and aetiology of diarrhoeal disease in infants and young children in developing countries (the Global Enteric Multicenter Study, GEMS): a prospective, case-control study. The Lancet. 2013;382 (9888):209-222. doi:10.1016/S0140-6736(13)60844-2Striepen, B. Parasitic infections: time to tackle cryptosporidiosis / B. Striepen // Nature News. – 2013. – Vol. 503(7475). – P. 189-191. – DOI 10.1038/503189aStriepen B. Parasitic infections: time to tackle cryptosporidiosis. Nature News. 2013;503(7475):189-191. doi:10.1038/503189aWang, R. Prevalence and molecular identification of Cryptosporidium spp. / R. Wang, S. Qiu, F. Jian, S. Zhang, Y. Shen, L. Zhang, C. Ning, J. Cao, M. Qi, L. Xiao // Parasitol Res. – 2010. – Vol. 107. – P. 1489-1494. – DOI 10.1007/s00436-010-2024-6Wang R, Qiu S, Jian F, Zhang S, Shen Y, Zhang L, Ning C, Cao J, Qi M, Xiao L. Prevalence and molecular identification of Cryptosporidium spp. Parasitol Res. 2010; 107: 1489-1494. doi:10.1007/s00436-010-2024-6Kennedy, G. A. Cryptosporidiosis in three pigs / G.A. Kennedy, G.L. Kreitner, A.C. Strafuss //Journal of the American Veterinary Medical Association. – 1977. – Т. 170. – №. 3. – С. 348-350.Kennedy GA, Kreitner GL, Strafuss AC. Cryptosporidiosis in three pigs. Journal of the American Veterinary Medical Association. 1977 Feb;170(3):348-350. PMID: 833036.Горбов, Ю.К. Распространение ассоциативных заболеваний с/х животных и опыт борьбы с ними в Мордовской АССР / Ю.К. Горбов, А.П. Мачинский // Паразитоценозы и ассоциативные болезни. М., – 1984. – С. 235-252.Gorbov YuK, Machinsky AP. The spread of associative diseases of agricultural animals and the experience of combating them in the Mordovian Autonomous Soviet Socialist Republic Parasitocenoses and associative diseases. M., 1984;235-252 [in Russ.]Кряжев, А.Л. Эпизоотологическая ситуация по криптоспоридиозу поросят в промышленном свиноводстве Вологодской области / А.Л. Кряжев, А.С. Новиков, В.Ф. Никитин. // Ветеринария. – 2020. – №1. – С. 30-34. – DOI 10.30896/0042-4846.2020.23.1.30-34Kryazhev AL, Novikov AS, Nikitin VF. Epizootological situation on cryptosporidiosis of piglets in industrial pig breeding in the Vologda region. Veterinary. 2020; 1:30-34. doi:10.30896/0042-4846.2020.23.1.30-34 [in Russ.]Новиков, А.С. Криптоспоридиоз поросят в условиях северо-западного Нечерноземья РФ / А.С. Новиков, А.Л. Кряжев // Монография // Вологда–Молочное: Вологодская ГМХА. – 2022. – 112 с.Novikov AS, Kryazhev AL. Cryptosporidiosis of piglets in the conditions of the north-western non-Chernozem region of the Russian Federation. Monograph Vologda-Molochnoe: Vologda GMHA. 2022;112. [in Russ.]Ryan, U.M. Taxonomy and molecular epidemiology of Cryptosporidium and Giardia–a 50-year perspective (1971–2021) / U.M. Ryan, Y. Feng, R. Fayer, L. Xiao // International Journal for Parasitology. – 2021. – Т. 51. – №. 13-14. – С. 1099-1119. – DOI 10.1016/j.ijpara.2021.08.007Ryan UM, Feng Y, Fayer R, Xiao L. Taxonomy and molecular epidemiology of Cryptosporidium and Giardia - a 50-year perspective (1971-2021). Int J Parasitol. 2021 Dec;51(13-14):1099-1119. doi: 10.1016/j.ijpara.2021.08.007.Chen, Y. Global prevalence of Cryptosporidium spp. in pigs: a systematic review and metaanalysis / Y. Chen, H. Qin, Y. Wu, H. Xu, J. Huang, J. Li, L. Zhang // Parasitology. – 2023. – С. 1-38 – DOI 10.1017/S0031182023000276Chen Y, Qin H, Wu Y, et al. Global prevalence of Cryptosporidium spp. in pigs: a systematic review and meta-analysis. Parasitology. 2023;150(6):531-544. doi:10.1017/S0031182023000276Němejc, K. Occurrence of Cryptosporidium suis and Cryptosporidium scrofarum on commercial swine farms in the Czech Republic and its associations with age and husbandry practices / K. Němejc, B. Sak, D. Květoňová, N. Kernerová, M. Rost, V.A. Cama, M. Kváč // Parasitology research. – 2013. – Vol. 112(3). – P. 1143-1154. – DOI 10.1007/s00436-012-3244-8Němejc K, Sak B, Květoňová D, Kernerová N, Rost M, Cama VA, Kváč M. Occurrence of Cryptosporidium suis and Cryptosporidium scrofarum on commercial swine farms in the Czech Republic and its associations with age and husbandry practices. Parasitology research. 2013;112(3):1143-1154. doi:10.1007/s00436-012-3244-8Wang, W. Prevalence of Cryptosporidium in pigs in China: A systematic review and meta‐analysis / Wang W., Gong Q. L., Zeng A., Li M. H., Zhao Q., & Ni H. B. // Transboundary and Emerging Diseases. – 2021. – Т. 68. – №. 3. – С. 1400-1413. – DOI 10.1111/tbed.13806Wang W, Gong QL, Zeng A, et al. Prevalence of Cryptosporidium in pigs in China: A systematic review and meta-analysis. Transboundary and Emerging Diseases. 2021 May;68(3): 1400-1413.doi:10.1111/tbed.13806Wang, P. The infection and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in diarrheic pigs in southern China / P. Wang, S. Li, Y. Zou, Z.C. Du, D. P. Song, P. Wang, X.Q. Chen // Microbial Pathogenesis. – 2022. – Т. 165. – С. 105459. – DOI 10.1016/j.micpath.2022.105459Wang P, Li S, Zou Y, et al. The infection and molecular characterization of Cryptosporidium spp. in diarrheic pigs in southern China. Microbial Pathogenesis. 2022 Apr; 165:105459. doi:10.1016/j.micpath.2022.105459Feng, Y. Genetic diversity and population structure of Cryptosporidium / Y. Feng, U.M. Ryan, L. Xiao // Trends in parasitology. – 2018. – Т. 34. – №. 11. – С. 997-1011. – DOI 10.1016/j.pt.2018.07.009Feng Y, Ryan UM, Xiao L. Genetic Diversity and Population Structure of Cryptosporidium. Trends in Parasitology. 2018 Nov;34(11):997-1011. doi:10.1016/j.pt.2018.07.009.Pettersson, E. Detection and molecular characterisation of Cryptosporidium spp. in Swedish pigs / E. Pettersson, H. Ahola, J. Frössling, P. Wallgren, K. Troell // Acta Veterinaria Scandinavica. – 2020. – Vol. 62 (1). – P. 1-7. – DOI 10.1186/s13028-020-00537-zPettersson E, Ahola H, Frössling J, Wallgren P, Troell K. Detection and molecular characterisation of Cryptosporidium spp. in Swedish pigs. Acta Veterinaria Scandinavica. 2020; 62(1):1-7. doi:10.1186/s13028-020-00537-zКряжев, А.Л. Идентификация таксономической принадлежности криптоспоридий у поросят в условиях северо-запада РФ при помощи молекулярно-генетических методов / А.Л. Кряжев, А.С. Новиков // Российский паразитологический журнал. – 2023. – Т. 17. – №. 1. – С. 84-90. – DOI 10.31016/1998-8435-2023-17-1-84-90Kryazhev AL, Novikov AS, Identification of the taxonomic affiliation of cryptosporidium in piglets in the north-west of the Russian Federation using molecular genetic methods. Russian Journal of Parasitology. 2023; 17(1):84-90. doi:10.31016/1998-8435-2023-17-1-84-90 [in Russ.]Pavlásek, I. Cryptosporidia: biology, diagnosis, host spectrum, specificity, and the environment / I. Pavlásek //Remedia Klin. Mikrobiol. – 1999. – Vol. 3. – P. 290-301.Pavlásek I. Cryptosporidia: biology, diagnosis, host spectrum, specificity, and the environment Remedia Klin. Mikrobiol. 1999; 3: 290-301.Rahimah, A. B. Freezedrying of oil palm (Elaeis guineensis) leaf and its effect on the quality of extractable DNA / A.B. Rahimah, S.C. Cheah, S. Rajinder // J. Oil Palm Res. – 2006. – Vol. 18. – P. 296-304.Rahimah AB, Cheah SC, Rajinder S. Freeze-drying of oil palm (Elaeis guineensis) leaf and its effect on the quality of extractable DNA. J. Oil Palm Res. 2006; 18: 296-304.Zheng, S. Molecular identification and epidemiological comparison of Cryptosporidium spp. among different pig breeds in Tibet and Henan, China / S. Zheng, D. Li, C. Zhou, S. Zhang, Y. Wu, Y. Chang, ... & L. Zhang // BMC veterinary research. – 2019. – Vol. 15. – №. 1. – P. 1-8. – DOI 10.1186/s12917-019-1847-3Zheng S, Li D, Zhou C, Zhang S, Wu Y, Chang Y, Zhang L. Molecular identification and epidemiological comparison of Cryptosporidium spp. among different pig breeds in Tibet and Henan, China. BMC veterinary research. 2019; 15(1):1-8. doi:10.1186/s12917-019-1847-3Callahan, B.J. H. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data / B.J. Callahan, P.J. McMurdie, M.J. Rosen, A.W. Han, A.J.A. Johnson, S.P. Holmes // Nature methods. – 2016. – 13. – P. 581-583. – DOI 10.1038/nmeth.3869Callahan BJ, McMurdie PJ, Rosen MJ, et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 2016 Jul;13(7):581-583. doi:10.1038/nmeth.3869.Maddox-Hyttel, C. Cryptosporidium and Giardia in different age groups of Danish cattle and pigs-Occurrence and management associated risk factors / C. Maddox-Hyttel, R. Langkjær, H. Enemark, H. Vigre // Vet Parasitol. – 2006. – Vol. 141. – P. 48-59. – DOI 10.1016/j.vetpar.2006.04.032Maddox-Hyttel C, Langkjær R, Enemark H, Vigre H. Cryptosporidium and Giardia in different age groups of Danish cattle and pigs-Occurrence and management associated risk factors. Vet Parasitol. 2006; 141:48-59. doi: 10.1016/j.vetpar.2006.04.032Hamnes, I. Occurrence of Cryptosporidium and Giardia in suckling piglets in Norway / I. Hamnes, B. Gjerde, T. Forberg, L. Robertson // Vet Parasitol. – 2007. – Vol. 144. – P. 222-33. – DOI 10.1016/j.vetpar.2006.10.011Hamnes I, Gjerde B, Forberg T, Robertson L. Occurrence of Cryptosporidium and Giardia in suckling piglets in Norway. Vet Parasitol. 2007;144: 222-33. doi: 10.1016/j.vetpar.2006.10.011Guselle, N. Biology of Cryptosporidium parvum in pigs: from weaning to market / N. Guselle, A. Appelbee, M. Olson // Vet Parasitol. – 2003. – Vol. 113(1). – P. 7-18. – DOI 10.1016/S0304-4017(03)00039-6Guselle N, Appelbee A, Olson M. Biology of Cryptosporidium parvum in pigs: from weaning to market. Vet Parasitol. 2003;113 (1):7-18. doi:10.1016/S0304-4017(03)00039-6Johnson, J. Prevalence of Cryptosporidium genotypes in pre- and post-weaned pigs in Australia / J. Johnson, R. Buddle, S. Reid, A. Armson, U. Ryan // Exp Parasitol. – 2008. – Vol. 119. – P. 418-421. – DOI 10.1016/j.exppara.2008.04.009Johnson J, Buddle R, Reid S, Armson A, Ryan U. Prevalence of Cryptosporidium genotypes in pre- and post-weaned pigs in Australia. Exp Parasitol. 2008; 119: 418-421. doi: 10.1016/j.exppara.2008.04.009Zou, Y. Prevalence and risk factors of Cryptosporidium infection in farmed pigs in Zhejiang, Guangdong, and Yunnan provinces, China / Y. Zou, J.G. Ma, D.M. Yue, W.B. Zheng, X.X. Zhang, Q. Zhao, X.Q. Zhu // Tropical animal health and production. – 2017. – Vol. 49(3). – P. 653-657. – DOI 10.1007/s11250-017-1230-yZou Y, Ma JG, Yue DM, Zheng, WB, Zhang XX, Zhao Q, Zhu XQ. Prevalence and risk factors of Cryptosporidium infection in farmed pigs in Zhejiang, Guangdong, and Yunnan provinces, China. Tropical animal health and production. 2017; 49(3):653-657. doi:10.1007/s11250-017-1230-yYin, J. H. Agerelated Infection with Cryptosporidium Species and Genotype in Pigs in China[J]. / J.H. Yin, Z.Y. Yuan, H.X. Cai, Y.J. Shen, Y.Y. Jiang, J. Zhang, Y.J. Wang, J.P. Cao //Biomedical and Environmental Sciences. – 2013. –Vol. 26(6). – P. 492-495. – DOI 10.3967/0895-3988.2013.06.010Yin JH, Yuan ZY, Cai HX, Shen YJ, Jiang YY, Zhang J, Wang YJ, Cao JP. Age-related infection with Cryptosporidium species and genotype in pigs in China. Biomed Environ Sci. 2013 Jun;26(6):492-5. doi: 10.3967/0895-3988.2013.06.010.Kváč, M. Age related susceptibility of pigs to Cryptosporidium scrofarum infec-tion / M. Kváč, K. Němejc, M. Kestřánová, D. Květoňová, P. Wagnerová, M. Kotková, M. Rost et al. // Vet Parasitol. – 2014. – Vol. 202(3-4). – P. 330-334. – DOI 10.1016/j.vetpar.2014.02.012Kváč M, Němejc K, Kestřánová M, Květoňová D, Wagnerová P, Kotková M, Rost M, et al. Age-related susceptibility of pigs to Cryptosporidium scrofarum infection. Vet Parasitol. 2014;202(3-4):330-334. doi: 10.1016/j.vetpar.2014.02.012Zhang, W. Prevalence and genetic characterizations of Cryptosporidium spp in pre-weaned and post-weaned piglets in Heilongjiang Province, China / W. Zhang, F. Yang, A. Liu, R. Wang, L. Zhang, Y. Shen et al. // PLoS One. – 2013. – Vol. 8. – P. е67564. – DOI 10.1371/journal.pone.0067564Zhang W, Yang F, Liu A, Wang R, Zhang L, Shen Y, et al. Prevalence and genetic characterizations of Cryptosporidium spp in pre-weaned and post-weaned piglets in Heilongjiang Province, China. PLoS One. 2013;8:е67564. doi:10.1371/journal.pone.0067564

The authors declare that there are no conflicts of interest present.