ivmМеждународный вестник ветеринарииInternational Journal of Veterinary Medicine2072-2419SpbGUVM Publishing House10.52419/issn2072-2419.2024.1.350ivm-1342Research ArticleАКУШЕРСТВО, ГИНЕКОЛОГИЯOBSTETRICS, GYNECOLOGYСравнение методов морфологической оценки сперматозоидов баранов с использованием набора SPERM BLUE и окрашивания по Романовскому-ГимзеComparison of methods for morphological evaluation of sheep spermatozoa using the SPERM BLUE kit and Romanovsky-Giemse staininghttps://orcid.org/0000-0002-7011-4594КорочкинаЕ. А.KorochkinaE. A.

 д. ветеринар. наук, доц. кафедры генетических и репродуктивных биотехнологий 

 PhD. In Veterinary science, Associate Professor, Department of Genetic and Reproductive Technologies 

e.kora@mail.ruФинагеевЕ. Ю.FinageevE. Y.

 канд. ветеринар. наук, асс. кафедры генетических и репродуктивных биотехнологий 

 PhD. In Veterinary sciences, Assistant, Department of Genetic and Reproductive Technologies 

ГлавацкаяД. Е.GlavatskayaD. E.

 студ. 

 student 

ПушкинаВ. С.PushkinaV. S.

 студ. 

 student 

ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины»РоссияSt. Petersburg state university of veterinary medicineRussian Federation20240204202401350355Copyright © Корочкина Е.А., Финагеев Е.Ю., Главацкая Д.Е., Пушкина В.С., 20242024Корочкина Е.А., Финагеев Е.Ю., Главацкая Д.Е., Пушкина В.С.Korochkina E.A., Finageev E.Y., Glavatskaya D.E., Pushkina V.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vetjournal.spbguvm.ru/jour/article/view/1342

Целью настоящего исследования являются апробация и сравнительная оценка методов морфологического исследования сперматозоидов баранов с использованием набора дифференцированного окрашивания Sperm Blue и окрашивания по Романовскому-Гимзе. Было проведено взятие и исследование спермы баранов породы Дорпер. Для проведения морфологической оценки сперматозоидов, полученные образцы (n=10) разводили в соотношении 1:100 (фосфатным буферным солевым раствором PBS). Для морфологической оценки сперматозоидов использовали два метода: набор дифференцированного окрашивания Sperm Blue (Microptic, экспозиция мазка в фиксаторе - 10 минут, в основном красителе – 18 минут) и окрашивание по Романовскому-Гимзе (экспозиция мазка в фиксаторе - 10 минут, в основном красителе – 20 минут). После рутинного окрашивания промывали мазки дистиллированной водой, высушивали и проводили микроскопию (увеличение с использованием объектива 100х10, иммерсионное масло) с последующим ручным методом подсчета количества морфологических форм сперматозоидов (200 сперматозоидов в каждом образце). Согласно результатам сравнительного анализа окрашенных мазков, окрашивание красителем Sperm Blue позволяет провести детальное морфологическое исследование и определить тератозооспермические характеристики сперматозоидов. При окрашивании по Романовскому-Гимзе нормальные сперматозоиды были четко видны, вместе с тем плохо визуализировалась акросома. Стоит отметить, что подсчет процента нормальных сперматозоидов вручную с использованием обоих красителей привел к одинаковому десятичному результату. Была обнаружена статистически незначимая разница в дефектах головки и хвоста между использованными красителями (p = 0,41 и p = 0,77 соответственно): при окрашивании по Романовскому-Гимзе (7,8% и 34,1%) были обнаружены данные дефекты чаще, чем Sperm Blue (6,3% и 32,9%). Учитывая полученные результаты, актуальным является использование красителя Sperm Blue в ветеринарной андрологии, в частности для оценки морфологии сперматозоидов разных видов животных с дальнейшей разработкой соответствующих протоколов в аспекте длительности экспозиции самих мазков в основном красителе.

The purpose of this study is to test and comparatively evaluate the method of morphological examination of ram sperm using a differentiated staining Sperm Blue and Romanovsky-Giemsa staining. The sperm of Dorper rams was collected and examined. The obtained samples (n=10) were diluted in a ratio of 1:100 (PBS solution) to conduct a morphological assessment of sperm. Two methods were used for the morphological assessment of spermatozoa: a set of differentiated staining Sperm Blue (Microptic, exposure of the smear in the fixative – 10 minutes, in the main dye - 18 minutes) and Romanovsky-Giemsa staining (exposure of the smear in the fixative - 10 minutes, in the main dye – 20 minutes). After routine staining, the smears were washed with distilled water, dried, and microscopy was performed (magnification using a 100x10 immersion objective, oil immersion), followed by a manual method of counting the number of morphological forms of sperm. According to the results of a comparative analysis of stained smears, staining with Sperm Blue allows for a detailed morphological study and differentiation of teratozoospermic characteristics. When stained with Romanovsky-Giemsa, normal spermatozoa were clearly visible, but the acrosome was poorly visualized. Manual calculation of the percentage of normal sperm using both dyes resulted in the same decimal result. A statistically insignificant difference in head and tail defects was found between the dyes used (p = 0.41 and p = 0.77, respectively): Romanovsky-Giemsa staining (7.8% and 34.1%) detected these defects more often than Sperm Blue (6.3% and 32.9%). Considering the results obtained, the use of the Sperm Blue dyes dye in veterinary andrology is relevant, in particular for assesment the morphology of sperm of different animal species with the further development of appropriate protocols in terms of the duration of exposure of the smears themselves to the main dye.

сперматозоиды баранаморфологическая оценканабор Sperm Blueокрашивание по Романовскому-Гимзеram spermatozoamorphological assessmentSperm Blue kitRomanovsky-Giemsa stainingИсследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-26-00157, https://rscf.ru/project/23-26-00157/The study was supported by a grant from the Russian Science Foundation№ 23-26-00157, https://rscf.ru/ project/23-26-00157/ReferencesБаженова, Н. Б. Оценка качественных показателей спермы животных: учебно-методическое пособие / Н. Б. Баженова, К. В. Племяшов, Е. А. Корочкина. – Санкт-Петербург: Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины, 2023. – 25 с. Режим доступа: https://www.elibrary.ru/item.asp?id=54902245Bazhenova, N. B. Assessment of quality indicators of animal sperm: educational manual / N. B. Bazhenova, K. V. Plemyashov, E. A. Korochkina. – St. Petersburg: St. Petersburg State University of Veterinary Medicine, 2023. – 25 p. URL: https://www.elibrary.ru/item.asp?id=54902245ГОСТ 32222–2013.Средства воспроизводства. Сперма. Методы отбора проб. – Веден 2015-01-27. – М.: Стандартинформ, 2018. – 10 с.GOST 32222–2013. Means of reproduction. Sperm. Sampling methods. – Veden January 27, 2015 – M.: Standartinform, 2018. – 10 p.Корочкина, Е. А. Репродуктивная способность самцов в условиях стресса и методы ее коррекции: Учебно-методическое пособие / Е. А. Корочкина, Е. Ю. Финагеев, В. В. Никитин. – Санкт-Петербург: ООО "Издательство "ЛЕМА", 2023. – 31 с. – ISBN 978-5-00105-861-8.Korochkina, E. A. Reproductive ability of males under stress and methods for its correction: educational manual / E. A. Korochkina, E. Yu. Finageev, V. V. Nikitin. – St. Petersburg: LEMA Publishing House LLC, 2023. – 31 p. – ISBN 978-5-00105-861-8. URL: https://www.elibrary.ru/item.asp?id=54758856Корочкина, Е. А. Оценка морфологии сперматозоидов баранов с помощью набора быстрого дифференцированного окрашивания Диахим-Дифф-Квик / Е. А. Корочкина, Е. Ю. Финагеев, М. М. Ивановская // Ветеринария. – 2023. – № 7. – С. 38-42. – DOI 10.30896/0042-4846.2023.26.7.38-42. Режим доступа: https://www.elibrary.ru/item.asp?id=54146135Korochkina, E. A. Assessment of ram sperm morphology using a rapid differential staining kit Dia-Diff-Quick / E. A. Korochkina, E. Yu. Finageev, M. M. Ivanovskaya // Veterinary Medicine. – 2023. – No. 7. – P. 38-42. – DOI 10.30896/0042-4846.2023.26.7.38-42. URL: https://www.elibrary.ru/item.asp?id=54146135Способы подготовки самцов-пробников и использование их в репродуктивной биотехнологии: Учебно-методическое пособие для вузов / К. В. Племяшов, Е. Ю. Финагеев, Е. А. Корочкина [и др.]. – Санкт-Петербург: Издательство Лань, 2023. – 52 с. – (Высшее образование). – ISBN 978-5-507-46892-8.Methods for preparing sample males and their use in reproductive biotechnology: Educational and methodological manual for universities / K. V. Plemyashov, E. Yu. Finageev, E. A. Korochkina [etc.]. – St. Petersburg: Lan Publishing House, 2023. – 52 p. - (Higher education). – ISBN 978-5-507-46892-8. – EDN. URL: https://www.elibrary.ru/item.asp?id=58196592Chenoweth, P. J. (2005). Genetic sperm defects. Theriogenology, 64(3), 457–468. 10.1016/J.THERIOGENOLOGY.2005.05.005Chenoweth, P. J. (2005). Genetic sperm defects. Theriogenology, 64(3), 457–468. 10.1016/J.THERIOGENOLOGY.2005.05.005.Farias L.B. Comparison of Diff-Quick and Spermac Staining Methods for Sperm Morphology Evaluation / L.B. Farias, da Cunha Barreto-Vianna AR, de Mello MD, Dos Santos AL, da Fonte Ramos C, Fontoura P. J Reprod Infertil. 2023 Jul-Sep;24(3):166-170. doi: 10.18502/jri. v24i3.13272. Режим доступа: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37663429/Farias L.B. Comparison of Diff-Quick and Spermac Staining Methods for Sperm Morphology Evaluation / L.B. Farias, da Cunha Barreto-Vianna AR, de Mello MD, Dos Santos AL, da Fonte Ramos C, Fontoura P. J Reprod Infertil. 2023 Jul-Sep;24(3):166-170. doi: 10.18502/jri. v24i3.13272.Kolster, K. A. (2018). Evaluation of canine sperm and management of semen disorders. Veterinary Clinics of North America – Small Animal Practice, 48(4), 533–545. 10.1016/j.cvsm.2018.02.003. Режим доступа: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29678334/Kolster, K. A. (2018). Evaluation of canine sperm and management of semen disorders. Veterinary Clinics of North America—Small Animal Practice, 48(4), 533–545. 10.1016/j.cvsm.2018.02.003. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29678334/Peña Martínez, A. I. (2004). Canine fresh and cryopreserved semen evaluation. Animal Reproduction Science, 82–83, 209–224. 10.1016/J.ANIREPROSCI.2004.04.024. Режим доступа: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378432004000788Peña Martínez, A. I. (2004). Canine fresh and cryopreserved semen evaluation. Animal Reproduction Science, 82–83, 209–224. 10.1016/J.ANIREPROSCI.2004.04.024.Van der Horst G. SpermBlue: a new universal stain for human and animal sperm which is also amenable to automated sperm morphology analysis / G. Van der Horst, L. Maree Biotech // Histochem. 2009 Dec;84 (6):299-308.Van der Horst G. SpermBlue: a new universal stain for human and animal sperm which is also amenable to automated sperm morphology analysis / G. Van der Horst, L. Maree Biotech // Histochem. 2009 Dec;84 (6):299-308.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.