ivmМеждународный вестник ветеринарииInternational Journal of Veterinary Medicine2072-2419SpbGUVM Publishing House10.52419/issn2072-2419.2024.2.49ivm-1369Research ArticleИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИINFECTIOUS DISEASESЭкспрессия в E. Coli маркированного рекомбинантного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свинейExpression of the labeled recombinant glycoprotein E2 of the classical swine fever virus in E. Colihttps://orcid.org/0000-0003-2650-6459ГалееваА. Г.GaleevaA. G.

канд. ветеринар. наук, ст. науч. сотр., зав. лабораторией вирусных антропозоонозов 

cand. Veterinarian. sciences, art. scientific. comp., head. laboratory of Viral Anthropozoonoses  

https://orcid.org/0000-0001-8786-1310ЕфимоваМ. А.EfimovaM. A.

д-р ветеринар. наук, вед. науч. сотр. 

 Doctor of Veterinary Sciences, Ved. sci. 

https://orcid.org/0000-0001-5279-9836УсольцевК. В.UsoltsevK. V.

канд. ветеринар. наук, вед. науч. сотр. 

 cand. Veterinarian. sciences, ved. science. co–author 

https://orcid.org/0000-0001-5279-9836НасыровШ. М.NasyrovSh. M.

канд. ветеринар. наук, вед. науч. сотр. 

 cand. Veterinarian. sciences, ved. science 

https://orcid.org/0000-0001-5669-1486ХаммадовН. И.HammadovN. I.

канд. биол. наук, вед. науч. сотр. 

 cand. Biol. nauk, ved. nauk 

https://orcid.org/0009-0006-0211-3334АхуноваА. Р.AkhunovaA. R.

мл. науч. сотр. 

 ml. scientific 

https://orcid.org/0000-0001-9879-378XХайруллинР. Ф.KhairullinR. F.

канд. хим. наук, ст. науч. сотр. 

 Candidate of Chemical Sciences, art. sotr.

https://orcid.org/0000-0002-0413-5936ЯруллинаГ. М.YarullinaG. M.

мл. науч. сотр.  

ml. scientific. sotr. 

ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»РоссияFederal Center for Toxicological, Radiation, and Biological SafetyRussian FederationФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины»РоссияFederal Center for Toxicological, Radiation, and Biological Safety; Kazan State Academy of Veterinary MedicineRussian FederationФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»РоссияKazan (Volga Region) Federal UniversityRussian Federation202428062024024957Copyright © Галеева А.Г., Ефимова М.А., Усольцев К.В., Насыров Ш.М., Хаммадов Н.И., Ахунова А.Р., Хайруллин Р.Ф., Яруллина Г.М., 20242024Галеева А.Г., Ефимова М.А., Усольцев К.В., Насыров Ш.М., Хаммадов Н.И., Ахунова А.Р., Хайруллин Р.Ф., Яруллина Г.М.Galeeva A.G., Efimova M.A., Usoltsev K.V., Nasyrov S.M., Hammadov N.I., Akhunova A.R., Khairullin R.F., Yarullina G.M.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vetjournal.spbguvm.ru/jour/article/view/1369

В настоящее время в Российской Федерации для специфической профилактики классической чумы свиней (КЧС) применяются живые аттенуированные вакцины, однако данная стратегия противоречит правилам импорта животной продукции и несет риски рекомбинации с полевыми штаммами. Эти факторы обостряют необходимость дальнейшей разработки кандидатных рекомбинантных вакцин с аналогичной эффективностью и безопасностью. Целью представленной работы явилось конструирование прокариотической системы экспрессии маркированного гликопротеина Е2 вируса КЧС и оценка его иммунохимических свойств. В результате проведенных исследований при помощи биоинформатического анализа был идентифицирован участок первичной аминокислотной последовательности гликопротеина Е2 высокопатогенного штамма вируса КЧС «Ши-Мынь» (субгенотип 1.1) и выполнен дизайн гибридного полипептида, включающего неспецифическую (маркерную) часть из модифицированного эпитопа V5 и фрагмента последовательности BSA. Путем клонирования кодонно-оптимизированного фрагмента в вектор pET-28a был сконструирован штамм-продуцент E. coli BL21(DE3) pLysS/pET-28a/E2-V5. В ходе оптимизации условий культивирования штамма-продуцента было установлено, что наибольший выход целевого белка достигается в течение 5-6 ч после индукции экспрессии. Были определены иммунохимические свойства хроматографически очищенного рекомбинантного rE2-V5: так, было показано, что его активность в непрямом иммуноферментном анализе превышает таковую нативного Е2. Полученные данные свидетельствуют об эффективности разработанной прокариотической системы экспрессии, заключающейся в правильном фолдинге, хорошей растворимости и способности целевого белка образовывать специфические иммунокомплексы. Наличие маркерного фрагмента в экспрессируемом гибридном полипептиде в перспективе позволит использовать последний в качестве основы рекомбинантной вакцины, отвечающей требованиям стратегии DIVA.

Currently, live attenuated vaccines are used in the Russian Federation for the specific prevention of classical swine fever (CSF), but this strategy contradicts the rules for importing animal products and carries the risks of recombination with field strains. These factors exacerbate the need for further development of candidate recombinant vaccines with similar efficacy and safety. The aim of the presented work was to construct a prokaryotic expression system of the marked glycoprotein E2 of the CSF virus and to evaluate its immunochemical properties. As a result of the conducted studies, a section of the primary amino acid sequence of glycoprotein E2 of a highly pathogenic Shimen strain (subgenotype 1.1) was identified using bioinformatic analysis and a hybrid polypeptide was designed, including a non-specific (marker) part from the modified V5 epitope and a fragment of the BSA sequence. By cloning a codon-optimized fragment into the pET-28a vector, the E. coli BL21(DE3) pLysS/pET-28a/E2-V5 producing strain was constructed. During the optimization of the cultivation conditions of the producer strain, it was found that the highest yield of the target protein is achieved within 5-6 hours after the induction of expression. The immunochemical properties of chromatographically purified recombinant rE2-V5 were determined: for example, it was shown that its activity in indirect enzyme immunoassay exceeds that of native E2. The data obtained indicate the effectiveness of the developed prokaryotic expression system, which consists in proper folding, good solubility and the ability of the target protein to form specific immunocomplexes. The presence of a marker fragment in the expressed hybrid polypeptide in the future will allow using the latter as the basis of a recombinant vaccine that meets the requirements of the DIVA strategy.

классическая чума свинейрекомбинантная вакцинапрокариотическая система экспрессииE. coliхроматографическая очисткаиммуноферментный анализclassical swine feverrecombinant vaccineprokaryotic expression systemE. colichromatographic purificationenzyme immunoassayМатериалы подготовлены в рамках темы НИР ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 4.2 «Разработка технологии производства рекомбинантной вакцины против классической чумы свиней» (2024-2026 гг.).Materials were prepared within the framework of the research topic in FCTRBS-ARRVI 4.2 «Development of technology for the production of a recombinant vaccine against classical swine fever» (2024 -2026).ReferencesАлексеев К.П., Раев С.А., Южаков А.В., Шемельков Е.В., Латышев О.Е., Елисеева О.В., Костина Л.В., Цибезов В.В., Стаффорд В.В., Кунаков В.Ю., Верховский О.А., Забережный А.Д., Алипер Т.И. Разработка и испытание образцов рекомбинантной субъединичной вакцины против классической чумы свиней. Сельскохозяйственная биология. 2019; 54(6): 1236-1246. DOI: 10.15389/agrobiology.2019.6.1236rus.Alekseev K.P., Raev S.A., Yuzhakov A.V., Shemelkov E.V., Latyshev O.E., Eliseeva O.V., Kostina L.V., Tsibezov V.V., Stafford V.V., Kunakov V.Yu., Verkhovsky O.A., Zaberezhny A.D., Aliper T.I. Development and testing of recombinant subunit vaccine samples against the classic swine fever. Agricultural biology. 2019; 54(6): 1236-1246. DOI: 10.15389/agrobiology.2019.6.1236rus.Сергеев В.А., Орлянкин Б.Г., Алексеев К.П., Забережный А.Д., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А. Вакцины и стратегия вакцинации против классической чумы свиней. Ветеринария. 2018; 4: 3-11.Sergeev V.A., Orlyankin B.G., Alekseev K.P., Zaberezhny A.D., Aliper T.I., Nepoklonov E.A. Vaccines and vaccination strategy against classical swine fever. Veterinary medicine. 2018; 4: 3-11.Оганесян А.С., Шевцов А.А., Щербаков А.В., Коренной Ф.И., Караулов А.К. Классическая чума свиней: ретроспективный анализ эпизоотической ситуации в Российской Федерации (2007-2021 гг.) и прогноз на 2022 г. Ветеринария сегодня. 2022; 11(3): 229-238. DOI: 10.29326/2304-196X-2022-11-3-229-238.Oganesyan A.S., Shevtsov A.A., Shcherbakov A.V., Korennoy F.I., Karaulov A.K. Classical swine fever: a retrospective analysis of the epizootic situation in the Russian Federation (2007-2021) and forecast for 2022. Veterinary medicine today. 2022; 11 (3): 229-238. DOI: 10.29326/2304-196X-2022-11-3-229-238.Шемельков Е.В., Булгаков А.Д., Куликова Т.С., Верховский О.А., Кунаков В.Ю., Котельников А.П., Алипер Т.И. Изучение продолжительности поствакцинального иммунного ответа при использовании субъединичной маркированной вакцины против классической чумы свиней. Аграрная наука. 2022; 3: 23-27. DOI: 10.32634/0869-8155-2022-357-3-23-27.Shemelkov E.V., Bulgakov A.D., Kulikova T.S., Verkhovsky O.A., Kunakov V.Yu., Kotelnikov A.P., Aliper T.I. Study of the duration of the post-vaccination immune response when using a subunit labeled vaccine against classical swine fever. Agricultural science. 2022; 3: 23-27. DOI: 10.32634/0869-8155-2022-357-3-23-27.Алипер Т.И., Алексеев К.П., Шемельков Е.В., Верховский О.А., Забережный А.Д. Перспектива использования маркированных вакцин против классической чумы свиней в Российской Федерации. Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов: материалы МПК, посвященной 100-летию Армавирской биофабрики. 2021. 54-60. DOI: 10.47804/978-5-89904-028-3_2021_ 54.Aliper T.I., Alekseev K.P., Shemelkov E.V., Verkhovsky O.A., Zaberezhny A.D. The prospect of using labeled vaccines against classical swine fever in the Russian Federation. Scientific foundations of the production and quality assurance of biological preparations: materials of the IPC dedicated to the 100th anniversary of the Armavir Biofactory. 2021. 54-60. DOI: 10.47804/978-5-89904-028-3_2021_ 54.Wang F., Yu Q., Hu M., Xing G., Zhao D., Zhang G. Purification of Classical Swine Fever Virus E2 Subunit Vaccines Based on High Affinity Peptide Ligand. Protein Pept Lett. 2021; 28(5):554-562. DOI: 10.2174/0929866527666201103152100.Wang F., Yu Q., Hu M., Xing G., Zhao D., Zhang G. Purification of Classical Swine Fever Virus E2 Subunit Vaccines Based on High Affinity Peptide Ligand. Protein Pept Lett. 2021; 28(5):554-562. DOI: 10.2174/0929866527666201103152100.Kumar R., Kumar V., Kekungu P., Barman N.N., Kumar S. Evaluation of surface glycoproteins of classical swine fever virus as immunogens and reagents for serological diagnosis of infections in pigs: a recombinant Newcastle disease virus approach. Arch Virol. 2019; 164: 3007-3017. DOI: 10.1007/s00705-019-04425-4.Kumar R., Kumar V., Kekungu P., Barman N.N., Kumar S. Evaluation of surface glycoproteins of classical swine fever virus as immunogens and reagents for serological diagnosis of infections in pigs: a recombinant Newcastle disease virus approach. Arch Virol. 2019; 164: 3007-3017. DOI: 10.1007/s00705-019-04425-4.Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidaselabeled antibody: a new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12). DOI: 10.1177/22.12.1084.Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidaselabeled antibody: a new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12). DOI: 10.1177/22.12.1084.Патент RU2250263C1. Андреев В.Г., Безбородова С.В. Рекомбинантная плазмидная ДНК p30NE2, кодирующая 181-аминокислотный N-концевой фрагмент гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней и обеспечивающая его экспрессию в клетках E. coli. Заявитель и патентообладатель – ФГУ «ВНИИЗЖ». Дата публикации – 27.01.2005.Patent RU2250263C1. Andreev V.G., Bezborodova S.V. Recombinant plasmid DNA p30NE2 encoding the 181-amino acid N-terminal fragment of glycoprotein E2 of the classical swine fever virus and ensuring its expression in E. coli cells. The applicant and the patent holder is the Federal State Institution «ARRIAH». Date of publication – 27.01.2005.Патент RU2406534C2. Толедо Алонсо Х.Р., Санчес Рамос О., Баррера Валле М.И., Фигероа Байле Н.Э., Прието Карратала Я., Родригес Мольто М.П., Фриас Лепуро М.Т., Боррото Нордело К.Г. Химерные вакцинные антигены против вируса классической чумы свиней. Заявитель и патентообладатель – Сентро де Инхеньерия Хенетика и Биотекнолохия (CU). Дата публикации – 07.09.2007.Patent RU2406534C2. Toledo Alonso H.R., Sanchez Ramos O., Barrera Valle M.I., Figueroa Baile N.E., Prieto Carratala Ya., Rodriguez Molto M.P., Frias Lepuro M.T., Borroto Nordelo K.G. Chimeric vaccine antigens against classical swine fever virus. The applicant and the patent holder is Centro de Ingeneria Henetika i Bioteknolohija (CU). Date of publication – 07.09.2007.Patent EP2382307B1. Kortekaas J.A., Vloet R.P.M. Recombinant classical swine fever virus (CSFV) comprising a modified E2 protein and methods for generating said recombinant CSFV. Current Assignee: Intervet International BV. Publication date: 02.11.2011.Patent EP2382307B1. Kortekaas J.A., Vloet R.P.M. Recombinant classical swine fever virus (CSFV) comprising a modified E2 protein and methods for generating said recombinant CSFV. Current Assignee: Intervet International BV. Publication date: 02.11.2011.Wei Q., Liu Yu., Zhang G. Research Progress and Challenges in Vaccine Development against Classical Swine Fever Virus. Viruses. 2021; 13(3): 445. DOI: 10.3390/v13030445.Wei Q., Liu Yu., Zhang G. Research Progress and Challenges in Vaccine Development against Classical Swine Fever Virus. Viruses. 2021; 13(3): 445. DOI: 10.3390/v13030445.Kimple M. E., Brill A. L., Pasker R. L. Overview of affinity tags for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. 2013; 73(9).Kimple M. E., Brill A. L., Pasker R. L. Overview of affinity tags for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. 2013; 73(9).

The authors declare that there are no conflicts of interest present.