ivmМеждународный вестник ветеринарииInternational Journal of Veterinary Medicine2072-2419SpbGUVM Publishing House10.52419/issn2072-2419.2025.2.30ivm-1683Research ArticleИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИINFECTIOUS DISEASESИзыскание генетических маркеров для ПЦР-РВ индикации возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыбSearch for genetic markers for PCR-RV indication of the causative agent of viral hemorrhagic septicemia in fishhttps://orcid.org/0000-0002-0416-6193ГромоваЕ. А.GromovaE. A.

канд. биол. наук, ст. науч. сотр.

Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher

elizaveta-real@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4709-314XМиргазовД. А.MirgazovD. A.

мл. науч. сотр.

Junior Researcher 

https://orcid.org/0000-0002-6919-4064ДодоноваЕ. А.DodonovaE. A.

мл. науч. сотр. 

Junior Researcher

https://orcid.org/0000-0003-2763-8605ОсянинК. А.OsyaninK. A.

канд. биол. наук, вед. науч. сотр. 

Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher

https://orcid.org/0000-0002-0707-2117ГорбуноваМ. Е.GorbunovaM. E.

канд. биол. наук, науч. сотр.

Candidate of Biological Sciences, Researcher

https://orcid.org/0000-0002-0891-9826МакаеваА. Р.MakaevaA. R.

канд. биол. наук, ст. науч. сотр.

Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher 

ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»РоссияFederal State Budgetary Scientific Institution "Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety" Russian Federation202501082025023038Copyright © Громова Е.А., Миргазов Д.А., Додонова Е.А., Осянин К.А., Горбунова М.Е., Макаева А.Р., 20252025Громова Е.А., Миргазов Д.А., Додонова Е.А., Осянин К.А., Горбунова М.Е., Макаева А.Р.Gromova E.A., Mirgazov D.A., Dodonova E.A., Osyanin K.A., Gorbunova M.E., Makaeva A.R.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vetjournal.spbguvm.ru/jour/article/view/1683

Вирусная геморрагическая септицемия является одной из наиболее опасных болезней рыб, наносящих существенный урон экономическому развитию аквакультуры. В Российской Федерации диагностические мероприятия по выявлению данного возбудителя, как правило, базируются на серологических подходах. Однако, наиболее быстрыми и точными являются молекулярногенетические методы диагностики, в основе которых лежит полимеразная цепная реакция. Целью данной работы явилась разработка комбинации праймеров и зонда, пригодной для специфической ПЦР-индикации вируса геморрагической септицемии в режиме реального времени. На первом этапе работы был осуществлен биоинформационный анализ доступных, на сегодняшний день, нуклеотидных последовательностей геномов возбудителя вирусной геморрагической септицемии. Проанализировав последовательности данного вируса, в пределах гена N, кодирующего нуклеопротеин, определен маркерный локус размером 180 п.о. В пределах данного локуса разработаны праймеры и зонд, пригодные для выявления изолятов вирусной геморрагическая септицемии в формате полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. В результате серии экспериментов, проведенных на кДНК, выделенных из вирусных культур VHSV ЧФ 1.2, VHSV 22- ARM, IHNV и IPN, была определена программа амплификации и состав реакционной смеси. Установлено, что разработанные праймеры обладают 100 % специфичностью, а чувствительность может достигать 12 копий вирусных частиц на микролитр. Таким образом, подобранные в рамках данной работы нуклеотидные маркеры и сконструированные на их основе праймеры и зонд обладают всеми необходимыми характеристиками необходимыми для использования их в качестве основы тест-системы, позволяющей проводить быструю ПЦР-индикацию вируса для выявления и идентификации возбудителя вирусной геморрагическая септицемии.

Viral hemorrhagic septicemia is one of the most dangerous fish diseases, causing significant damage to the economic development of aquaculture. In the Russian Federation, diagnostic measures to identify this pathogen are usually based on serological approaches. However, the fastest and the most accurate methods are molecular genetic diagnostic methods based on the polymerase chain reaction. The aim of this work was to develop a combination of primers and probe suitable for specific PCR indication of hemorrhagic septicemia virus in real time. At the first stage of the work, a bioinformatic analysis of the currently available nucleotide sequences of the genomes of the viral hemorrhagic septicemia causative agent was carried out. After analyzing the sequences of this virus, a marker locus of 180 bp was determined inside of the N gene encoding the nucleoprotein. Inside of this locus, primers and a probe suitable for detecting isolates of viral hemorrhagic septicemia in the real time polymerase chain reaction were developed. As a result of a series of experiments conducted on cDNAs isolated from VHSV CF 1.2 and VHSV 22-ARM virus cultures, the 1.2 and VHSV 22-ARM virus cultures, the amplification program and the composition of the reaction mixture were determined. It has been established that the developed primers have 100% specificity, and sensitivity can reach 12 copies of virus particles per microliter. Thus, the nucleotide markers selected as part of that work and the primers and probe constructed on their basis have all the characteristics necessary for their use as the basis of a test system that allows for rapid PCR indication of the virus to detect and identify the causative agent of viral hemorrhagic septicemia.

вирусная геморрагическая септицемияОТ-ПЦРчувствительностьспецифичностьгенетические маркерыдиагностикаviral hemorrhagic septicemiaRT-PCRsensitivityspecificitygenetic markersdiagnosisReferencesYusuff S., Kurath G., Kim M.S., Tesfaye T.M., Li J., McKenney D.G., Vakharia V.N. The glycoprotein, non-virion protein, and polymerase of viral hemorrhagic septicemia virus are not determinants of host-specific virulence in rainbow trout. Virol J. 2019; 16 (1):31. https://doi.org/10.1186/s12985-019-1139-3Yusuff S., Kurath G., Kim M.S., Tesfaye T.M., Li J., McKenney D.G., Vakharia V.N. The glycoprotein, non-virion protein, and polymerase of viral hemorrhagic septicemia virus are not determinants of host-specific virulence in rainbow trout. Virol J. 2019; 16 (1):31. https://doi.org/10.1186/s12985-019-1139-3Baillon L., Mérour E., Cabon J., Louboutin L., Vigouroux E, Alencar ALF, Cuenca A, Blanchard Y, Olesen NJ, Panzarin V, Morin T, Brémont M, Biacchesi S. The Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV) Markers of Virulence in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). Front Microbiol. 2020; 11:574231. https:// doi.org/10.3389/fmicb.2020.574231.Baillon L., Mérour E., Cabon J., Louboutin L., Vigouroux E, Alencar ALF, Cuenca A, Blanchard Y, Olesen NJ, Panzarin V, Morin T, Brémont M, Biacchesi S. The Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV) Markers of Virulence in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). Front Microbiol. 2020; 11:574231. https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.574231.Kim H.J., Cuenca A., Olesen N. J Validation of a novel one-step reverse transcription polymerase chain reaction method for detecting viral haemorrhagic septicaemia virus. Aquaculture. 2018; 492:170-183. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2018.03.047.Kim H.J., Cuenca A., Olesen N. J Validation of a novel one-step reverse transcription polymerase chain reaction method for detecting viral haemorrhagic septicaemia virus. Aquaculture. 2018; 492:170-183. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2018.03.047.Ito T., Kurita J., Mori K., Olesen N.J. Virulence of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) genotype III in rainbow trout. Vet Res.; 47:4. https://doi.org/10.1186/s13567-015-0303-zIto T., Kurita J., Mori K., Olesen N.J. Virulence of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) genotype III in rainbow trout. Vet Res.; 47:4. https://doi.org/10.1186/s13567-015-0303-zПыльнов В. А., Бурлаченко И. В., Бычкова Л. И. Применение гнездового варианта ПЦР (ОТ-ПЦР) для диагностики вируса геморрагической септицемии у лососевых рыб. Актуальные вопросы пресноводной аквакультуры: Сборник научных трудов Филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «ВНИРО» («ВНИИПРХ»). 2023; 94:122- 129.Pylnov V.A., Burlachenko I.V., Bychkova L.I. Application of the nest PCR variant (RT -PCR) for the diagnosis of hemorrhagic septicemia virus in salmon fish. Current issues of freshwater aquaculture : Collection of scientific papers of Branch for the freshwater fisheries of the Federal State Budget Scientific Institution “Russian Federal Research Institute of Fisheries and oceanography”. 2023; 94:122-129 (In Russ.).Анисимова Е.А., Додонова Е.А., Миргазов Д.А., Фахрутдинов Н.А., Елизарова И.А., Панкова Е.В., Осянин К.А. Подбор оптимальных условий постановки ПЦР для идентификации возбудителя бруцеллеза собак. Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2023; 12(230):55-59. https:// oi.org/10.53083/1996-4277-2023-230-12- 55-59.Anisimova E.A., Dodonova E.A., Mirgazov D.A., Fakhrutdinov N.A., Elizarova I.A., Pankova E.V., Osyanin K.A. Selection of optimal conditions of PCR setup to identify canine brucellosis causative agent. Bulletin of Altai State Agricultural University. 2023; 12(230):55-59. https://doi.org/10.53083/1996-4277-2023-230-12- 55-59 (In Russ.).Громова Е.А., Миргазов Д.А., Додонова Е.А., Елизарова И.А., Горбунова М.Е., Осянин К.А. Разработка мультиплексной ПЦР-РВ тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза. Ветеринарный врач. 2024; 3:34-40. https://doi.org/10.33632/1998-698X_2024_3_34.Gromova E.A., Mirgazov D.A., Dodonova E.A., Elizarova I.A., Gorbunova M.E., Osyanin K.A. Development of a multiplex RTPCR test system for detecting the causative agent of brucellosis. The Veterinarian. 2024; 3:34-40. https://doi.org/10.33632/1998-698X_2024_3_34 (In Russ.).Громова Е.А., Осянин К.А., Додонова Е.А., Горбунова М.Е., Хаммадов Н.И., Макаева А.Р. Генетические маркеры для ПЦР-индикации вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых рыб. Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. 2024; 5:88-94.Gromova E.A., Osyanin K.A., Dodonova E.A., Gorbunova M.E., Khammadov N.I., Makaeva A.R. Genetic markers for PCR indication of salmonid infectious hematopoietic necrosis virus. Bulletin of Kursk State Agricultural Academy. 2024; 5:88-94 (In Russ.).Chico V., Gomez N., Estepa A., Perez L. Rapid detection and quantitation of viral hemorrhagic septicemia virus in experimentally challenged rainbow trout by real-time RT-PCR. J Virol Methods. 2006; 132(1- 2):154-9. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2005.10.005Chico V., Gomez N., Estepa A., Perez L. Rapid detection and quantitation of viral hemorrhagic septicemia virus in experimentally challenged rainbow trout by real-time RT-PCR. J Virol Methods. 2006; 132(1- 2):154-9. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2005.10.005Warg J.V, Clement T., Cornwell E.R, Cruz A., Getchell R.G, Giray C., Goodwin A.E, Groocock G.H., Faisal M., Kim R., Merry G.E., Phelps N.B., Reising M.M., Standish I., Zhang Y., Toohey-Kurth K. Detection and surveillance of viral hemorrhagic septicemia virus using real-time RT-PCR. II. Diagnostic evaluation of two protocols. Dis Aquat Organ. 2014; 111(1):15-22. https://doi.org/10.3354/dao02758Warg J.V, Clement T., Cornwell E.R, Cruz A., Getchell R.G, Giray C., Goodwin A.E, Groocock G.H., Faisal M., Kim R., Merry G.E., Phelps N.B., Reising M.M., Standish I., Zhang Y., Toohey-Kurth K. Detection and surveillance of viral hemorrhagic septicemia virus using real-time RT-PCR. II. Diagnostic evaluation of two protocols. Dis Aquat Organ. 2014; 111(1):15-22. https://doi.org/10.3354/dao02758Тарасова А. С., Перчун А. В., Мельников В. П. Применение полимеразной цепной реакции для выявления возбудителей некоторых особо опасных вирусных болезней рыб. Ветеринария сегодня. 2020; 1 (32):11-16. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2020-1-32-11-16Tarasova A. S., Perchun A. V., Melnikov V. P. Polymerase chain reaction for detection of some highly dangerous viral fish disease agents. Veterinary Science Today. 2020; 1(32):11-16. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2020-1-32-11-16Перчун А. В., Воробьев В. В., Мельников В. П. Обнаружение особо опасных вирусных болезней рыб семейства лососёвых (Salmo salar) с применением полимеразной цепной реакции. Рыбное хозяйство. 2022; 5:88-93. https://doi.org/10.37663/0131-6184-2022-5-88-93Perchun A.V., Vorobyov V.V., Melnikov V.P. Detection of particularly dangerous viral diseases of salmon fish (Salmo salar) using polymerase chain reaction. Fisheries. 2022; 5:88-93. https://doi.org/10.37663/0131-6184-2022-5-88-93

The authors declare that there are no conflicts of interest present.