ivmМеждународный вестник ветеринарииInternational Journal of Veterinary Medicine2072-2419SpbGUVM Publishing House10.52419/issn2072-2419.2025.3.37ivm-1788Research ArticleИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИINFECTIOUS DISEASESПолучение и определение серологической активности рекомбинантного О-антигена бруцелл, синтезированного в эукариотической системе экспрессииPreparation and determination of the serological activity of recombinant brucella O-antigen synthesized in the eukaryotic expression systemhttps://orcid.org/0000-0001-5669-1486ХаммадовН. И.КhammadovN. I.

канд. биол. наук, вед. науч. сотр. 

Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher

nikhammadov@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-0416-6193ГромоваЕ. А.GromovaE. A.

канд. биол. наук, ст. науч. сотр.

Candidate of Biological Sciences, Senior researcher

https://orcid.org/0000-0002-0707-2117ГорбуноваМ. Е.GorbunovaM. E.

канд. биол. наук, науч. сотр.

Candidate of Biological Sciences, Researcher

https://orcid.org/0000-0003-2650-6459ГалееваА. Г.GaleevaA. G.

канд. ветеринар. наук, вед. науч. сотр. 

Candidate of Veterinary Sciences, Leading Researcher

https://orcid.org/0000-0002-5587-486XКосаревМ. А.KosarevM. A.

канд. биол. наук, вед. науч. сотр. 

Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher

https://orcid.org/0000-0001-5279-9836УсольцевК. В.UsoltsevK. V.

канд. ветеринар. наук, вед. науч. 

Candidate of Veterinary Sciences, Leading Researcher

https://orcid.org/0000-0001-8786-1310ЕфимоваМ. А.EfimovaM. A.

д-р биол., наук, вед. науч. сотр.

Doctor of Biological Sciences, leading researcher

ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; ФГБОУ ВО Казанский ГАУ Институт "Казанская академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана"РоссияFSBSI «Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety»; FSBEI HE «Kazan State Academy of Veterinary Medicine named after N.E. Bauman»Russian FederationФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»РоссияFSBSI «Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety»Russian Federation202507012026033746Copyright © Хаммадов Н.И., Громова Е.А., Горбунова М.Е., Галеева А.Г., Косарев М.А., Усольцев К.В., Ефимова М.А., 20252025Хаммадов Н.И., Громова Е.А., Горбунова М.Е., Галеева А.Г., Косарев М.А., Усольцев К.В., Ефимова М.А.Кhammadov N.I., Gromova E.A., Gorbunova M.E., Galeeva A.G., Kosarev M.A., Usoltsev K.V., Efimova M.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vetjournal.spbguvm.ru/jour/article/view/1788

Бруцеллез представляет собой опасное зоонозное заболевание, вызываемое бактериями рода Brucella, которое оказывает существенное негативное влияние на продуктивность сельскохозяйственных животных. В Российской Федерации успехи в борьбе с данным заболеванием у крупного рогатого скота связаны с использованием вакцины, созданной на основе штамма Brucella abortus 82, а также своевременным выявлением инфицированных животных. Настоящая работа посвящена получению и изучению серологической активности рекомбинантного О-антигена для индикации антител против бруцеллеза. В результате проведения поисковых запросов в базе данных GenBank нами идентифицирована аминокислотная последовательность О-полисахаридного антигена бруцелл – WP_002967174.1. Данную последовательность оптимизировали для трансляции белка на культуре клеток млекопитающих, синтезировали и клонировали в плазмиду pVAX1. Наработку pVAX1 проводили путем трансформации клеток Escherichia coli штамма DH5α методом теплового шока, с селекцией по гену устойчивости к канамицину с дальнейшим выделением и очисткой плазмидной ДНК. Трансфекция клеток HEK293 полу ченной генетической конструкцией приводила к экспрессии целевого антигена, факт наличия которого в жидкости, отобранной с клеточной культуры, установили с помощью вертикального электрофореза в 12 % ПААГ по результату визуализации мажорных паттернов на уровне 70 кДа. В результате ионообменной и гель-фильтрационной хроматографии удалось получить очищенный О-антиген в растворенном виде в концентрации 4,7 мг/мл. Полученный препарат был применен в разведении 10 мкг/мл, в качестве антигена, при проведении непрямого твердофазного ИФА для индикации антител в сыворотках крови крупного рогатого скота против S и R антигена бруцелл. Коэффициент специфичности рассчитывали относительно данных ИФА с сывороткой крови в разведении 1:256. Так при реакции с сывороткой крови крупного рогатого скота против Brucella abortus коэффициент специфичности составил 6,29, против S и R антигенов бруцелл – 6,1 и 6.77 соответственно. Результаты исследования могут внести значительный вклад в развитие методов диагностики и лечения бруцеллеза, а также в создание новых вакцинных препаратов.

Brucellosis is a dangerous zoonotic disease caused by bacteria of the genus Brucella. having a significant negative impact on the productivity of farm animals. In the Russian Federation, successes in the fight against this disease in cattle are associated with the use of a vaccine based on the Brucella abortus 82 strain, as well as the timely detection of infected animals. This work is devoted to the preparation and study of the serological activity of recombinant O-antigen for the indication of antibodies against brucellosis. As a result of conducting search queries in the GenBank database, we identified the amino acid sequence of the O-polysaccharide antigen brucella –WP_002967174.1. This sequence was optimized for protein translation in mammalian cell culture, synthesized, and cloned into the pVax1 plasmid. pVax1 was developed by transformation of Escherichia coli cells of the DH5a strain by heat shock, with selection for the kanamycin resistance gene with further isolation and purification of plasmid DNA. Transfection of HEK293 cells with the resulting genetic construct led to the expression of the target antigen, the presence of which in the liquid taken from the cell culture was established using vertical electrophoresis in 12% PAAG based on the visualization of major patterns at the level of 70 kDa. As a result of ion exchange and gel filtration chromatography, it was possible to obtain purified O-antigen in dissolved form at a concentration of 4.7 mg/ml. The resulting drug was used in a dilution of 10 micrograms/ml, as an antigen, during indirect solid-phase ELISA to indicate antibodies in bovine blood sera against S and R brucella antigen. The coefficient of specificity was calculated with respect to ELISA data with blood serum at a dilution of 1:256. Thus, in the reaction with bovine blood serum against Brucella abortus, the specificity coefficient was 6.29, against S and R brucella antigens – 6.1 and 6.77, respectively. The results of the study can make a significant contribution to the development of methods for the diagnosis and treatment of brucellosis, as well as to the creation of new vaccine preparations.

cattlebrucellosisrecombinant O-antigenantibodiesenzyme immunoassay (ELISA)cattlebrucellosisrecombinant O-antigenantibodiesenzyme immunoassay (ELISA)ReferencesНасибуллин Р.Ю. Применение пеногасителей при глубинном культивировании бруцелл. Ветеринарный врач. 2023; 4:33- 37. https://doi.org/10.33632/1998-698X_2023_4_33.Nasibullin R.Yu. The use of defoamers in submerged cultivation of Brucella. The Veterinarian. 2023; 4:33-37. 2023; 4:33-37. https://doi.org/10.33632/1998-698X_2023_4_33. (In Russ.).Булашев А.К., Акибеков О.С., Сыздыкова А.С., Сураншиев Ж.А., Ескендирова С.З. Cерологический потенциал рекомбинантных белков Brucella spp. в диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота. Вестник НГАУ (Новосибирский государственный аграрный университет). 2020; 1 (54):56-64. https://doi.org/10.31677/2072-6724-2020-54-1-56-64Bulashev A.K., Akibekov O.S., Syzdykova A.S., Suranshiev Zh.A., Eskendirova S.Z. Serological potential of recombinant proteins Brucella spp. in the diagnosis of cattle brucellosis. Bulletin of NGAU (Novosibirsk State Agrarian University). 2020; 1(54):56- 64. https://doi.org/10.31677/2072-6724-2020-54-1-56-64Анисимова Е.А., Миргазов Д.А., Додонова Е.А., Елизарова И.А., Панкова Е.В., Осянин К.А. Применение HRM-анализа кривых плавления, полученных после амплификации VNTR-локусов, для идентификации и дифференциации штаммов бруцелл. Проблемы особо опасных инфекций. 2023; 4:42-49. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2023-4-42-49Anisimova E.A., Mirgazov D.A., Dodonova E.A., Elizarova I.A., Pankova E.V., Osyanin K.A. Use of HRM-Analysis of the Melting Curves Obtained after Amplification of VNTR-Loci for Identification and Differentiation of Brucella Strains. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2023; 4:42-49. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2023-4-42-49. (In Russ.).Пономаренко Д.Г., Матвиенко А.Д., Хачатурова А.А., Жаринова И.В., Скударева О.Н., Транквилевский Д.В., Логвиненко О.В., Ракитина Е.Л., Костюченко М.В., Кондратьева Ю.В., Малецкая О.В., Куличенко А.Н. Анализ ситуации по бруцеллезу в мире и Российской Федерации. Проблемы особо опасных инфекций. 2024; 2:36-50. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2024-2-36-50Ponomarenko D.G., Matvienko A.D., Khachaturova A.A., Zharinova I.V., Skudareva O.N., Trankvilevsky D.V., Logvinenko O.V., Rakitina E.L., Kostyuchenko M.V., Kondrat’eva Yu.V., Maletskaya O.V., Kulichenko A.N. Analysis of the Situation on Brucellosis around the World and in the Russian Federation. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2024; 2:36-50. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2024-2-36-50 (In Russ.).Громова Е.А., Миргазов Д.А., Додонова Е.А., Елизарова И.А., Горбунова М.Е., Осянин К.А. Разработка мультиплексной ПЦР-РВ тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза. Ветеринарный врач. 2024; 3:34-40. https://doi.org/10.33632/1998-698X_2024_3_34Gromova E.A., Mirkhazov D.A., Dodonova E.A., Elizarova I.A., Gorbunova M.E., Osyanin K.A. Development of a multiplex RT-PCR test system for detecting the causative agent of Brucellosis. The Veterinarian. 2024; 3:34-40. https:// doi.org/10.33632/1998-698X_2024_3_34 (In Russ.).Булашев А.К., Акибеков О.С., Сыздыкова А., Сураншиев Ж.А., Инербай Б. Сравнительная оценка белков внешней мембраны Brucella в серодиагностике бруцеллеза. Актуальная биотехнология. 2020; 3 (34):86-90Bulashev A.K., Akibekov O.S., Syzdykova A., Suranshiev Zh.A., Inerbai B. Comparative evaluation of Brucella outer membrane proteins in the serodiagnosis of brucellosis. Current biotechnology. 2020; 3 (34):86-90 (In Russ.).Zygmunt M.S., Bundle D.R., Ganesh N.V., Guiard J., Cloeckaert A. Monoclonal Antibody-Defined Specific C Epitope of Brucella O-Polysaccharide Revisited. Clin Vaccine Immunol. 2015; 22(8):979-82. https://doi.org/10.1128/CVI.00225-15Zygmunt M.S., Bundle D.R., Ganesh N.V., Guiard J., Cloeckaert A. Monoclonal Antibody-Defined Specific C Epitope of Brucella O-Polysaccharide Revisited. Clin Vaccine Immunol. 2015; 22(8):979-82. https://doi.org/10.1128/CVI.00225-15.Усольцев К.В., Горбунова М.Е., Шангараев Р.И., Зайнуллин Л.И., Хаертынов К.С., Осянин К.А., Хаммадов Н.И. Применение синтетического пептида на основе иммуногенного эпитопа GP51 для серологической диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота. Международный вестник ветеринарии. 2024; 1:12-21. https://doi.org/10.52419/issn2072-2419.2024.1.12Usoltsev K.V., Gorbunova M.E., Shangaraev R.I., Zainullin L.I., Khaertynov K.S., Ostanin K.A., Khammatov N.I. The use of a synthetic peptide based on the immunogenic epitope gp51 for the serological diagnosis of bovine leukemia virus. International Bulletin of Veterinary Medicine. 2024; 1:12-21. https://doi.org/10.52419/issn2072-2419.2024.1.12. (In Russ.).Mirkalantari S., Zarnani A., Nazari M., Irajian G.R., Amirmozafari N. Brucella melitensis VirB12 recombinant protein is a potential marker for serodiagnosis of human brucellosis. Ann Clin. Microbiol. Antimicrob. 2017; 8 (16). https://doi.org/10.1186/s12941-017-0182-4Mirkalantari S., Zarnani A., Nazari M., Irajian G.R., Amirmozafari N. Brucella melitensis VirB12 recombinant protein is a potential marker for serodiagnosis of human brucellosis. Ann Clin. Microbiol. Antimicrob. 2017; 8 (16). https://doi.org/10.1186/s12941-017-0182-4.Ahmed I., Khairani-Bejo S., Hassan L. Serological diagnostic potential of outer membrane proteins (rOMPs) from Brucella melitensis in mouse model using indirect enzyme-linked immunosorbent assay. BMC Veterinary Research. 2015; І. (11): 275Ahmed I., Khairani-Bejo S., Hassan L. Serological diagnostic potential of outer membrane proteins (rOMPs) from Brucella melitensis in mouse model using indirect enzyme-linked immunosorbent assay. BMC Veterinary Research. 2015; І. (11): 275.Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E. Current Protocols in Molecular Biology Copyright. John Wiley&Sons, 2003. 4755 рAusubel F.M., Brent R., Kingston R.E. Current Protocols in Molecular Biology Copyright. John Wiley&Sons, 2003. 4755 рTian M., Li X., Yu L., Qian J., Bai X., Yang J., Deng R., Lu C., Zhao H., Liu Y. Glycosylation as an intricate post translational modification process takes part in glycoproteins related immunity. Cell Commun Signal. 2025; 5:23(1):214. https://doi.org/10.1186/s12964-025-02216-wTian M., Li X., Yu L., Qian J., Bai X., Yang J., Deng R., Lu C., Zhao H., Liu Y. Glycosylation as an intricate posttranslational modification process takes part in glycoproteins related immunity. Cell Commun Signal. 2025; 5:23(1):214. https://doi.org/10.1186/s12964-025-02216-w.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.