ivmМеждународный вестник ветеринарииInternational Journal of Veterinary Medicine2072-2419SpbGUVM Publishing House10.52419/issn2072-2419.2025.3.72ivm-1791Research ArticleИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИINFECTIOUS DISEASESАнализ полиморфизма гена LIPL32 патогенных лептоспир для разработки тест-системы с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времениAnalysis of the polymorphism of the LIPL32 gene of pathogenic leptospira for the development of a real-time polymerase chain reaction test systemhttps://orcid.org/0000-0003-3689-1442ШангараевР. И.ShangaraevR. I.

канд. ветеринар. наук, науч. сотр. 

Candidate of Veterinary Sciences, Researcher

rafkat.shangaraev@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-5279-9836УсольцевК. В.UsoltsevK. V.

канд. ветеринар. наук, вед. науч. сотр. 

Candidate of Veterinary Sciences, Leading Researcher

https://orcid.org/0000-0003-4764-560XХаертыновК. С.KhaertynovK. S.

канд. биол. наук, вед. науч. сотр. 

Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher

https://orcid.org/0000-0003-4446-4619ПанковаЕ. В.PankovaE. N.

канд. биол. наук, вед. науч. сотр. 

Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher

https://orcid.org/0000-0002-0707-2117ГорбуноваМ. Е.GorbunovaM. E.

канд. биол. наук, науч. сотр. 

Candidate of Biological Sciences, Researcher

https://orcid.org/0000-0001-5669-1486ХаммадовН. И.KhammadovN. I.

канд. биол. наук, вед. науч. сотр. 

Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher

https://orcid.org/0000-0003-2763-8605ОсянинК. А.OsyaninK. A.

канд. биол. наук, вед. науч. сотр. 

Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher 

ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»РоссияFederal State Budgetary Scientific Institution «Federal Center for Toxicological, Radiation, and Biological safety»Russian Federation202507012026037283Copyright © Шангараев Р.И., Усольцев К.В., Хаертынов К.С., Панкова Е.В., Горбунова М.Е., Хаммадов Н.И., Осянин К.А., 20252025Шангараев Р.И., Усольцев К.В., Хаертынов К.С., Панкова Е.В., Горбунова М.Е., Хаммадов Н.И., Осянин К.А.Shangaraev R.I., Usoltsev K.V., Khaertynov K.S., Pankova E.N., Gorbunova M.E., Khammadov N.I., Osyanin K.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vetjournal.spbguvm.ru/jour/article/view/1791

Целью данной работы являлось изучение полиморфизма гена LipL32 различных сероваров патогенных лептоспир, а также разработка прототипа тестсистемы для индикации данного гена с использованием метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с оценкой его стабильности. Объектами исследования служили 245 нуклеотидных последовательностей гена LipL32 Leptospira interrogans, образцы ДНК лептоспир сероваров Pomona, Grippotyphosa, Canicola, Bataviae и Tarassovi. По результатам биоинформационного анализа 245 нуклеотидных последовательностей гена LipL32 установили, что данный ген является высококонсервативным участком генома возбудителя лептоспироза. Для индикации исследуемого патогена по данному гену методом ПЦР-РВ, определили маркерный локус (область липопротеина L32) размером 173 пар нуклеотидов. В пределах данного участка разработали олигонуклеотидные праймеры и зонд, которые по данным множественного выравнивания амплифицируемого локуса оказались идентичными для большинства анализируемых нуклеотидных последовательностей гена LipL32 L. interrogans. BLAST-анализ отсеквенированных нуклеотидных последовательностей патогенных леп тоспир сероваров Pomona, Grippotyphosa, Canicola, Bataviae и Tarassovi показал, что идентичность амплифицированного сконструированными олигонуклеотидами участка гена липопротеина L32 указанных выше изолятов с последовательностями ДНК возбудителя лептоспироза, сохраненных в базе данных NCBI, варьировала от 95,74 до 98,95 %. С использованием разработанных олигонуклеоидов и флуоресцентного зонда сконструирован прототип тест-системы для индикации патогенных лептоспир методом ПЦРРВ. Установлено, что специфичность представленного в настоящей работе тест- набора составила 100 %, а чувствительность может достигать 5·102 копий ДНК в одном мл исследуемого материала. Результат оценки стабильности опытного образца тест-системы показал, что коэффициенты вариации минимальных пороговых значений не превышают 10 %, таким образом компоненты набора устойчивы к длительному хранению.

The purpose of this work was to study the polymorphism of the LipL32 gene of various pathogenic leptospira serovars, as well as to develop a prototype test system for the indication of this gene using the real-time polymerase chain reaction method with an assessment of its stability. The objects of the study were 245 nucleotide sequences of the LipL32 gene of Leptospira interrogans, DNA samples of leptospira serovars Pomona, Grippotyphosa, Canicola, Bataviae and Tarassovi. Based on the results of bioinformatic analysis of 245 nucleotide sequences of the LipL32 gene, it was established that this gene is a highly conserved region of the genome of the causative agent of leptospirosis. To indicate the pathogen under study for this gene by RT-PCR, a marker locus (lipoprotein L32 region) with a size of 173 nucleotide pairs was determined. Within this site, oligonucleotide primers and a probe were developed, which, according to multiple alignment of the amplified locus, turned out to be identical for most of the analyzed nucleotide sequences of the LipL32 L. interrogans gene. BLAST analysis of the sequenced nucleotide sequences of the pathogenic leptospira serovars Pomona, Grippotyphosa, Canicola, Bataviae and Tarassovi showed that the identity of the lipoprotein L32 gene region amplified by engineered oligonucleotides of the above isolates with DNA sequences of the causative agent of leptospirosis stored in the NCBI database ranged from 95.74 to 98.95%. Using the developed oligonucleotides and a fluorescent probe, a prototype test system for the detection of pathogenic leptospires by PCR-RV was constructed. It was found that the specificity of the test kit presented in this work was 100%, and the sensitivity could reach 5·102 copies of DNA per ml of the test material. The stability assessment of the test system showed that the variation coefficients of the minimum threshold values did not exceed 10%, indicating that the kit components were stable during long-term storage.

лептоспирозген LipL32BLAST-анализнуклеотидная последовательностьполимеразная цепная реакция в режиме реального времениполиморфизмсеквенированиестабильностьтест-системадиагностикаleptospirosisLipL32 genenucleotide substitutionBLAST- analysisnucleotide sequencereal-time polymerase chain reactionpolymorphismsequencingstabilitytest systemdiagnosisReferencesАнаньина, Ю. В. Паразитические и свободноживущие лептоспиры (Leptospiraceae): эколого-генетические особенности. Зоологический журнал. 2010; Т. 89 (1): 48-52.Ananyina, Yu.V. Parasitic and freeliving Leptospira (Leptospiraceae): ecological and genetic features / Yu. V. Ananyina // Zoological Journal, 2010; 89(1): 48-52. (In Russ.).Ulsenheimer B.C., Tonin A.A, von Laer A.E., Fernandes Dos Santos H., Antônio Sangioni L., Fighera R., Yuri Dos Santos M., Isabel Brayer Pereira D., Pötter L., De Avila Botton S. Molecular detection and phylogenetic analysis of Leptospira interrogans and Leptospira borgpetersenii in cats from Central region of Rio Grande do Sul state, Brazil. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2025; 116. 102286. https://doi:10.1016/j.cimid.2024.102286.Ulsenheimer B.C., Tonin A.A, von Laer A.E., Fernandes Dos Santos H., Antônio Sangioni L., Fighera R., Yuri Dos Santos M., Isabel Brayer Pereira D., Pötter L., De Avila Botton S. Molecular detection and phylogenetic analysis of Leptospira interrogans and Leptospira borgpetersenii in cats from Central region of Rio Grande do Sul state, Brazil. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2025; 116. 102286. https://doi:10.1016/j.cimid.2024.102286.Орынтаев, К.Б. Ермагамбетова С. Е., Меңтай А. Специфическая профилактика лептоспироза крупного рогатог скота. Вестник Кыргызского национального аграрного университета им. К.И. Скрябина. 2017; 4(45): 260-261.Oryntaev, K.B., Ermagambetova S.E., Mentai A.Specific prevention of bovine leptospirosis. Bulletin of the Kyrgyz National Agrarian University named after K.I. Scriabin. 2017; 4(45): 260-261. (In Russ.).Шангараев Р.И., Усольцев К.В., Хаертынов К.С., Горбунова М.Е., Хаммадов Н.И., Сафина Р.Ф., Осянин К.А. Обзор эпизоотической ситуации по лептоспирозу в Российской Федерации за период 2013-2023 гг. Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2024; 10(240): 65-72. https://doi:10.53083/1996-4277-2024-240-10-65-72.Shangaraev R. I., Usoltsev K.S. Khaertynov K.S, Gorbunova M.E., Khammadov N.I., Safina R.F., Osyanin K.A. Review of the epizootic situation of leptospirosis in the Russian Federation from 2013 through 2023. Bulletin of Altai State Agricultural University. 2024; 10(240): 65-72. https://doi:10.53083/1996-4277-2024-240-10-65-72. (In Russ.).Самсонова, А.П., Петров Е.М. Сравнение показателей эффективности методов диагностики лептоспирозов в разные сроки с момента заболевания. Бактериология. 2023; 8(3): 99.Samsonova, A.P., Petrov, E.M. Comparison of the effectiveness of diagnostic methods for leptospirosis at different times from the moment of the disease Bacteriology. 2023; 8(3): 99. (In Russ.).Нурлыгаянова, Г. А., Белоусов В. И., Шарыпов А. С. Результаты лабораторной диагностики лептоспироза животных различными методами в Российской Федерации за 2021 г. Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2023. 9: 75-86. https://doi:10.36871/vet.zoo.bio.202309009.Nurlygayanova, G.A. Belousov V.I., Sharypov A.S. Results of laboratory diagnostics of animal leptospirosis by various methods in the Russian Federation for 2021. Veterinary, Zootechnics and Biotechnology. 2023; 9: 75-86. https://doi:10.36871/vet.zoo.bio.202309009. (In Russ.).Хаммадов Н.И., Горбунова М.Е., Сальманова Г.Р., Фахрутдинов Н.А., Гулюкин А.М., Галеева А.Г., Громова Е.А. Конструирование специфических праймеров для ПЦР- диагностики классической чумы свиней. Ветеринарный врач. 2024; 3: 41-46. https://doi:10.33632/1998-698X_2024_3_41.Hammadov N. I., Gorbunova M. E., Salmanova G. R., Farhrutdinov N.I., Gulukin A.M., Galeeva A.G., Gromova E.A. Design of specific primers for PCR diagnostics of classical swine fever / [et al.] // The Veterinarian. 2024; 3: 41-46. https://doi:10.33632/1998-698X_2024_3_41. (In Russ.).Громова Е.А., Миргазов Д.А., Додонова Е.А., Елизарова И.А., Горбунова М.Е., Осянин К.А. Разработка мультиплексной ПЦР-РВ тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза. Ветеринарный врач. 2024; 3: 34-40. https://doi:10.33632/1998-698X_2024_3_34.Gromova E.A., Mirgazov D.A, Dodonova E.A., Elizarova I.A., Gorbunova M.E., Osyanin K.A. Development of a multiplex RTPCR test system for detecting the causative agent of brucellosis. The Veterinarian. 2024; 3: 34-40. https://doi 10.33632/1998-698X_2024_3_34. (In Russ.).Khaki P., Rahimi-Zarchi F., Moradi Bidhendi S., Gharakhani M. Application of a Multiplex PCR Assay for Molecular Identification of Pathogenic and Non-Pathogenic Leptospires based on LipL32 and 16S rRNA Genes. Arch. Razi. Inst. 2023; 78(1): 413- 418. https://doi:10.22092/ARI.2022.359211.2388.Khaki P., Rahimi-Zarchi F., Moradi Bidhendi S., Gharakhani M. Application of a Multiplex PCR Assay for Molecular Identification of Pathogenic and Non-Pathogenic Leptospires based on LipL32 and 16S rRNA Genes. Arch. Razi. Inst. 2023; 78(1): 413- 418. https://doi: 10.22092/ARI.2022.359211.2388.Podgoršek D., Ružić-Sabljić E., Logar M., Pavlović A., Remec T., Baklan Z., Pal E., Cerar T. Evaluation of real-time PCR targeting the LipL32 gene for diagnosis of Leptospira infection. BMC Microbiol. 2020; 20(1). https://doi: 10.1186/s12866-020-01744-4.Podgoršek D., Ružić-Sabljić E., Logar M., Pavlović A., Remec T., Baklan Z., Pal E., Cerar T. Evaluation of real-time PCR targeting the LipL32 gene for diagnosis of Leptospira infection. BMC Microbiol. 2020; 20(1). https://doi:10.1186/s12866-020-01744-4.Latifah I., Abdul Halim A., Rahmat M.S., Nadia M.F., Ubil Z.E., Asmah H., Shafariatul Akmar I., Picardeau M., Siti Haslina O., Nasir M.A. Isolation by culture and PCR identification of LipL32 gene of pathogenic Leptospira spp. in wild rats of Kuala Lumpur. Malaysian J. Pathol. 2017; 39 (2): 161-166.Latifah I., Abdul Halim A., Rahmat M.S., Nadia M.F., Ubil Z.E., Asmah H., Shafariatul Akmar I., Picardeau M., Siti Haslina O., Nasir M.A. Isolation by culture and PCR identification of LipL32 gene of pathogenic Leptospira spp. in wild rats of Kuala Lumpur. Malaysian J. Pathol. 2017; 39 (2): 161- 166.Vedhagiri K., Natarajaseenivasan K., Chellapandi P., Prabhakaran S.G., Selvin J., Sharma S., Vijayachari P. Evolutionary implication of outer membrane lipoproteinencoding genes ompL1, UpL32 and lipL41 of pathogenic leptospira species. Genomics Proteomics Bioinf. 2009; 7: 96-106. https://doi: 10.1016/S1672-0229(08)60038-8.Vedhagiri K., Natarajaseenivasan K., Chellapandi P., Prabhakaran S.G., Selvin J., Sharma S., Vijayachari P. Evolutionary implication of outer membrane lipoproteinencoding genes ompL1, UpL32 and lipL41 of pathogenic leptospira species. Genomics Proteomics Bioinf. 2009; 7: 96-106. https://doi:10.1016/S1672-0229(08)60038-8.Picardeau M., Bulach D.M, Bouchier C., Zuerner R.L., Zidane N., Wilson P.J., Creno S., Kuczek E.S., Bommezzadri S., Davis J.C., McGrath A., Johnson M.J., BoursauxEude C., Seemann T., Rouy Z., Coppel R.L., Rood J.I., Lajus A., Davies J.K., Médigue C., Adler B. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis PLoS. ONE. 2008; 3. https://doi: 10.1371/journal.pone.0001607.Picardeau M., Bulach D.M, Bouchier C., Zuerner R.L., Zidane N., Wilson P.J., Creno S., Kuczek E.S., Bommezzadri S., Davis J.C., McGrath A., Johnson M.J., BoursauxEude C., Seemann T., Rouy Z., Coppel R.L., Rood J.I., Lajus A., Davies J.K., Médigue C., Adler B. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis PLoS. ONE. 2008; 3. https://doi:10.1371/journal.pone.0001607.Nally J.E., Whitelegge J.P., Bassilian S., Blanco D. R., Lovett M. A. Characterization of the outer membrane proteome of Leptospira interrogans expressed during acute lethal infection Infect. Immun. 2007; 75766- 75773. https://doi: 10.1128/IAI.00741-06.Nally J.E., Whitelegge J.P., Bassilian S., Blanco D. R., Lovett M. A. Characterization of the outer membrane proteome of Leptospira interrogans expressed during acute lethal infection Infect. Immun. 2007; 75766- 75773. https://doi:10.1128/IAI.00741-06.Kumaran S.K., Faizal Abu Bakar M., Mohd-Radil H., Mat-Sharani S., Sakinah S., Poorani K., Alsaeedy H., Peli A., Seoh Wei T., Pooi Ling M., Awang Hamat R., Kumari Neela V., Higuchi A., Alarfaj A.A., Rajan M., Benelli G., Arulselvan P., Suresh Kumar S. 3D modelling of the pathogenic Leptospira protein LipL32: A bioinformatics approach. Acta Tropica. 2013; 76: 433-439. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2017.09.011.Kumaran S.K., Faizal Abu Bakar M., Mohd-Radil H., Mat-Sharani S., Sakinah S., Poorani K., Alsaeedy H., Peli A., Seoh Wei T., Pooi Ling M., Awang Hamat R., Kumari Neela V., Higuchi A., Alarfaj A.A., Rajan M., Benelli G., Arulselvan P., Suresh Kumar S. 3D modelling of the pathogenic Leptospira protein LipL32: A bioinformatics approach. Acta Tropica. 2013; 76: 433-439. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2017.09.011.Ваганова А.Н., Фрейлихман О.А., Стоянова Н.А., Токаревич Н.К. Межвидовой полиморфизм рестрикционных профилей гена lipL32 патогенных лептоспир. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010; 149(5): 543-545.Vaganova A.N., Freilikhman O.A., Stoyanova N.A., Tokarevich N.K. Genetics: interspecifi interspecifi c polymorphism of gene lipl32 restriction profiles of pathogenic leptospires. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2010; 149(5): 543-545. (In Russ.).

The authors declare that there are no conflicts of interest present.