ivmМеждународный вестник ветеринарииInternational Journal of Veterinary Medicine2072-2419SpbGUVM Publishing House10.52419/issn2072-2419.2026.1.38ivm-1986Research ArticleИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИINFECTIOUS DISEASESРазработка мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для одновременной индикации вирусов классической чумы свиней и болезни АуескиDevelopment of real-time multiplex PCR for simultaneous indication of classical swine fever and Aujeski's disease viruseshttps://orcid.org/0000-0001-5669-1486ХаммадовН. И.КhammadovN. I.

канд. биол. наук, вед. науч. сотр.

 Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher 

nikhammadov@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0002-0707-2117ГорбуноваМ. Е.GorbunovaM. E.

 канд. биол. наук, науч. сотр.

 Candidate of Biological Sciences, Researcher 

https://orcid.org/0000-0003-2356-133XСальмановаГ. Р.SalmanovaG. R.

 мл. науч. сотр.

 Junior Research

https://orcid.org/0000-0002-0416-6193ГромоваЕ. А.GromovaE. A.

 канд. биол. наук, ст. науч. сотр.

Candidate of Biological Sciences,Senior researcher 

https://orcid.org/0000-0001-5279-9836УсольцевК. В.UsoltsevK. V.

канд. ветеринар. наук, вед. науч. сотр. 

 Candidate of Veterinary Sciences, Leading Researcher 

https://orcid.org/0000-0003-2650-6459ГалееваА. Г.GaleevaA. G.

 канд. ветеринар. наук, вед. науч. сотр. 

Candidate of Veterinary Sciences, Leading Researcher

https://orcid.org/0000-0003-3558-3667СпиридоновГ. Н.SpiridonovG. N.

 доктор биол. наук, гл. науч. сотр.

 Doctor of Biological Sciences, Chief Researcher  

https://orcid.org/0000-0003-3689-1442ШангараевР. И.ShangaraevR. I.

канд. ветеринар. наук, науч. сотр. 

 Candidate of Veterinary Sciences, Researcher 

ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; ФГБОУ ВО Казанский ГАУ Институт "Казанская академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана"РоссияFSBSI «Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety»; FSBEI HE «Kazan Academy of Veterinary Medicine named after N.E. Bauman»Russian FederationФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»РоссияFSBSI «Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety»Russian FederationФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; ФГБОУ ВО Казанский ГАУ Институт "Казанская академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана"РоссияFSBSI «Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety»; FSBEI HE «Kazan Academy of Veterinary Medicine named after N.E. Bauman»Russian Federation202630042026013847Copyright © Хаммадов Н.И., Горбунова М.Е., Сальманова Г.Р., Громова Е.А., Усольцев К.В., Галеева А.Г., Спиридонов Г.Н., Шангараев Р.И., 20262026Хаммадов Н.И., Горбунова М.Е., Сальманова Г.Р., Громова Е.А., Усольцев К.В., Галеева А.Г., Спиридонов Г.Н., Шангараев Р.И.Кhammadov N.I., Gorbunova M.E., Salmanova G.R., Gromova E.A., Usoltsev K.V., Galeeva A.G., Spiridonov G.N., Shangaraev R.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vetjournal.spbguvm.ru/jour/article/view/1986

Особое внимание при проведении профилактических мероприятий, а также оперативных действий в случае возникновения вспышек классической чумы свиней (КЧС) и болезни Ауески (БА) следует уделять разработке и внедрению инновационных методов диагностики, что позволит своевременно выявлять и локализовать очаги инфекции. Целью данной работы являлось конструирование мультиплексной ПЦР-РВ тест-системы для диагностики классической чумы свиней и болезни Ауески. С помощью биоинформационного анализа нуклеотидных последовательностей вируса КЧС и возбудителя БА, обнаружены наиболее перспективные участки для индикации данных патогенов – размером 139 пар нуклеотидов (п.н.) расположенный в области генома вируса КЧС и 135 п.н. в области генома БА. Исходя из вариабельности нуклеотидных последовательностей выбранных регионов сконструированы олигонуклеотиды, пригодные для индикации искомых вирусов методом ПЦР-РВ в одной пробирке, используя разные каналы флуоресценции. Для каждой из созданных комбинаций олигонуклеотидов с использованием специально разработанного положительного контроля, который представляет собой генетическую конструкцию плазмидной ДНК (5827 п.н.), содержащую маркеры для обнаружения всех определяемых вирусов и образцов РНК/ДНК, полученных из биологического материала свиней, были проведены моно- и мульплексные реакции. На основании полученных результатов определена программа амплификации и оптимальный состав реакционной ПЦРРВ смеси. Установлено, что каждому биологическому патогену соответствовала индивидуальная флуоресцентная метка. Чувствительность разработанного ПЦР-РВ теста для диагностики КЧС и БА может достигать – 4 копии ДНК в реакционной смеси. При апробации способа мультиплексной ПЦР-РВ с использованием штаммов «ШиМынь» вируса КЧС и «Арский» возбудителя БА был получен следующий результат – рост сигнала флюоресценции по каналу ROX (Сt – 18.3) для КЧС и по каналу R6G (Сt – 22,6) – БА. Таким образом, нами продемонстрирована возможность проведения одновременной ПЦР для выявления геномов искомых возбудителей.

Special attention should be paid to the development and implementation of innovative diagnostic methods when carrying out preventive measures, as well as operational actions in the event of outbreaks of classical swine fever (CSF) and Aujesky's disease (AD), which will allow timely detection and localization of infection foci. The purpose of this work was to design a multiplex RT-PCR test system for the diagnosis of classical swine fever and Aujesky's disease. Using bioinformatic analysis of the nucleotide sequences of the CSF virus and the pathogen of AD, the most promising sites for the indication of these pathogens were found – 139 pairs of nucleotides (bp) in size located in the region of the CSF virus genome and 135 bp in the region of the AD genome. Based on the variability of the nucleotide sequences of the selected regions, oligonucleotides were constructed that are suitable for indicating the desired viruses by RT-PCR in one tube using different fluorescence channels. Mono- and multiplex reactions were performed for each of the created combinations of oligonucleotides using a specially developed positive control, which is a genetic construct of plasmid DNA (5827 bp) containing markers for the detection of all detectable viruses and RNA/DNA samples obtained from pig biological material. Based on the results obtained, the amplification program and the optimal composition of the reaction RT-PCR mixture were determined. It was found that an individual fluorescent label corresponded to each biological pathogen. The sensitivity of the developed RTPCR test for the diagnosis of CSF and AD can reach 4 copies of DNA in the reaction mixture. When testing the multiplex RTPCR method using the strains "ShImyn" of the CSF virus and "Arsky" of the causative agent AD, the following result was obtained – an increase in the fluorescence signal along the ROX channel (Ct – 18.3) for CSF and along the R6G channel (Ct – 22.6) for AD. Thus, we have demonstrated the possibility of simultaneous PCR to identify the genomes of the desired pathogens.

классическая чума свинейболезнь АуескиолигонуклеотидыдиагностикаПЦРclassical swine feverAujeski's diseaseoligonucleotidesdiagnosisPCRРабота выполнена за счет гранта, предоставленного Академией наук Республики Татарстан образовательным организациям высшего образования, научным и иным организациям на поддержку планов развития кадрового потенциала в части стимулирования их научных и научно-педагогических работников к защите докторских диссертаций и выполнению научно-исследовательских работ (Соглашение от 22.12.2025 № 4/2025-ПД-ВНИВИ).The work was carried out using a grant provided by the Academy of Sciences of the Republic of Tatarstan to higher education institutions, scientific and other organizations to support plans for the development of human resources in terms of stimulating their scientific and scientificpedagogical staff to defend doctoral dissertations and carry out research work (Agreement dated 22.12.2025 No. 4/2025- PD-VNIVI).ReferencesХаммадов Н.И., Горбунова М.Е., Сальманова Г.Р., Фахрутдинов Н.А., Гулюкин А.М., Галеева А.Г., Громова Е.А. Конструирование специфических праймеров для ПЦР- диагностики классической чумы. Ветеринарный врач. 2024; 3:41-46. https://doi.org/ 10.33632/1998-698X_2024_3_41Khammadov N.I., Gorbunova M.E., Salmanova G.R., Fakhrutdinov N.A., Gulyukin A.M., Galeeva A.G., Gromova E.A. Design of specific primers for PCR diagnosis of classical swine fever. The Veterinarian. 2024; 3:41-46. https://doi.org/10.33632/1998-698X_2024_3_41. (In Russ.)Аноятбекова А.М., Южаков А.Г., Аноятбеков М., Алипер Т.И., Гулюкин А.М. Атипичный пестивирус свиней (Pestivirus K) — новая проблема в промышленном свиноводстве (обзор). Сельскохозяйственная Биология. 2023; 58(2):260-273. https://doi.org/10.15389/agrobiology.2023.2.260rusAnoyatbekova A.M., Yuzhakov A.G., Anoyatbekov M., Aliper T.I., Gulyukin A.M. Atypical porcine pestivirus (Pestivirus K) — a new challenge for pig farming (review). Sel’skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2023; 58(2):260-273. https://doi.org/10.15389/agrobiology.2023.2.260rus. (In Russ.)Юсупова Г.Р. Влияние вакцины из штамма "КС" против классической чумы на иммунологические показатели свиней. Ветеринарный врач. 2008; 3:30-32.Yusupova G.R. The effect of the vaccine from the "KS" strain against classical plague on the immunological parameters of pigs. A veterinarian. 2008; 3:30-32. (In Russ.)Coronado L, Perera C.L., Rios L., Frías M.T., Pérez L.J. A Critical Review about Different Vaccines against Classical Swine Fever Virus and Their Repercussions in Endemic Regions. Vaccines (Basel). 2021; 15;9 (2):154. https://doi.org/10.3390/vaccines9020154Coronado L, Perera C.L., Rios L., Frías M.T., Pérez L.J. A Critical Review about Different Vaccines against Classical Swine Fever Virus and Their Repercussions in Endemic Regions. Vaccines (Basel). 2021; 15;9 (2):154. https://doi.org/10.3390/vaccines9020154Галеева А.Г., Усольцев К.В., Хаммадов Н.И., Насыров Ш.М. Дизайн антигенной композиции на основе фрагмента гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней. Ветеринарный врач. 2024; 1:28-33. https://doi.org/10.33632/1998-698Х_2024_1_28Galeeva A.G., Usoltcev K.V., Khammadov N.I., Nasyrov Sh.M. Design of antigenic composition based on partial E2 glycoprotein of classical swine fever virus. The Veterinarian. 2024; 1:28-33. https://doi.org/10.33632/1998-698Х_2024_1_28. (In Russ.)Галеева А.Г., Ефимова М.А., Усольцев К.В., Насыров Ш.М., Хаммадов Н.И., Ахунова А.Р., Хайруллин Р.Ф., Яруллина Г.М. Экспрессия в E. coli маркированного рекомбинантного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней. Международный вестник ветеринарии. 2024; 2:49-52. https://doi.org/10.52419/issn2072-2419.2024.2.49Galeeva A.G., Efimova M.A., Usoltsev K.V., Nasyrov SH.M., Hammadov N.I., Akhunova A.R., Khairullin R.F., Yarullina G.M. Expression of the labeled recombinant glycoprotein E2 of the classical swine fever virus in E. Coli. International Bulletin of Veterinary Medicine. 2024; 2:49-52. https://doi.org/10.52419/issn2072-2419.2024.2.49. (In Russ.)Балышева В.И., Жестерев В.И., Лошманова Н.И., Баньковская Н.С., Слищук Т.Е. Ассоциированная вакцина против болезни Ауески и болезни Тешена. Ветеринария. 2011; 9: 26-27.Baluisheva V.I., Zhesterev V.I., Loshmanova N.I., Bankovskaya N.S., Slishchuck T.Ye. Associated vaccine against Aujeszky's and Teschen diseases. Veterinariya. 2011; 9: 26-27. (In Russ.)Оганесян А.С., Шибаев М.А., Петрова О.Н., Баскакова Н.Е., Караулов А. К. Ситуационный анализ по болезням свиней: общая оценка рисков и приоритизация эпизоотических угроз для систем биозащиты свиноводческих предприятий в Российской Федерации. Ветеринария сегодня. 2024; 13 (3):82-291. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2024-13-3-282-29Oganesyan A. S., Shibayev M. A., Petrova O. N., Baskakova N. Ye., Karaulov А. К. Situational analysis on porcine diseases: general risk assessment and prioritization of epizootic threats to biosecurity systems of pig establishments in the Russian Federation. Veterinary Science Today. 2024; 13 (3): 282–291. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2024-13-3-282-291. (In Russ.)Чадаева А.А., Поволяева О.С., Лаптева О.Г., Луницин А.В., Юрков С.Г. Чувствительность культур клеток различного тканевого и видового происхождения к вирусу болезни Ауески. Ветеринария. 2021; 7:33-37. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2021.24.7.33-37Chadaeva A.A., Povolyaeva O.S., Lapteva O.G., Lunitsin A.V., Yurkov S.G. Sensitivity of cell cultures of various tissue and species origin to Aujeszky's disease virus. Veterinariya. 2021; 7:33-37. doi.org/10.30896/0042-4846.2021.24.7.33-37. (In Russ.)Баборенко Е. П. Изучение поствакцинального иммунитета при использовании вакцин против вируса болезни Ауески свиней из маркированного штамма. Ветеринария сегодня. 2016; 4(19):49-52.Baborenko E.P. Study of postvaccinal immunity after use of marked strain-based vaccine against Aujeszky''s disease in pigs. Veterinary Science Today. 2016; 4(19):49-52.Усольцев К.В., Шангараев Р.И., Хаертынов К.С., Горбунова М.Е., Хаммадов Н.И., Осянин К.А., Хамидуллина А.И. Дизайн праймеров для индикации патогенных лептоспир методом гнездовой полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2025; 2:95-106. https://doi.org/10.36871/vet.zoo.bio.202502111Usoltsev K.V., Shangaraev R.I., Khaertynov K.S., Gorbunova M.E., Khammadov N.I., Osyanin K.A., Khamidullina A.I. Design of primers for indication of pathogenic leptospira by nested polymerase chain reaction in real time. Veterinary, Zootechnics and Biotechnology. 2025; 2:95-106. https://doi.org/10.36871/vet.zoo.bio.202502111. (In Russ.)Оганесян А.С., Шевцов А.А., Щербаков А.В., Коренной Ф.И., Караулов А.К. Классическая чума свиней: ретроспективный анализ эпизоотической ситуации в Российской Федерации (2007-2021 гг.) и прогноз на 2022 г. Ветеринария сегодня. 2022; 11(3):229-238. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2022-11-3-229-238.Oganesyan A.S., Shevtsov A.A., Shcherbakov A.V., Korennoy F.I., Karaulov A.K. Classical swine fever: a retrospective analysis of the epizootic situation in the Russian Federation (2007-2021) and forecast for 2022. Veterinary Science Today. 2022; 11 (3):229-238. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2022-11-3-229-238. (In Russ.)Wang F.I., Deng M.C., Huang Y.L., Chang C.Y. Structures and Functions of Pestivirus Glycoproteins: Not Simply Surface Matters. Viruses. 2015; 29;7(7):3506-29. https://doi.org/10.3390/v7072783Wang F.I., Deng M.C., Huang Y.L., Chang C.Y. Structures and Functions of Pestivirus Glycoproteins: Not Simply Surface Matters. Viruses. 2015; 29;7(7):3506-29. https://doi.org/10.3390/v7072783Сизикова Т.Е., Мельникова Е.В., Маношкин А.В., Петров А.А., Мельников Д.Г., Пантюхов В.Б., Лебедев В.Н., Борисевич С.В. Использование внешних и внутренних контрольных образцов при постановке полимеразной цепной реакции и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 3:41-44.Sizikova T.E., Melnikova E.V., Manoshkin A.V., Petrov A.A., Melnikov D.G., Pantyukhov V.B., Lebedev V.N., Borisevich S.V. The use of external and internal control samples in the formulation of polymerase chain reaction and reverse transcription of polymerase chain reaction Clinical laboratory diagnostics. 2013; 3:41-44. (In Russ.)

The authors declare that there are no conflicts of interest present.