канд. ветеринар. наук, доц., зав. каф. зоологии и паразитологии
PhD in Veterinary Sciences, Associate Professor, Head of the Department of Zoology and Parasitology
специалист учебно-лабораторного комплекса
Specialist in the Educational and Laboratory Complex
Разработка высокопродуктивных пробиотических штаммов, способных к синтезу терапевтических белков, требует комплексного подхода, сочетающего генетическое конструирование с оптимизацией условий ферментации. В данном исследовании разработан и валидирован усовершенствованный протокол трехэтапного культивирования рекомбинантного штамма Lactobacillus spp., обеспечивающего коэкспрессию интерлейкинов IL-10 и IL-22, в биореакторе с автоматическим контролем критических параметров — pH, температура, растворенный кислород. В работе использовали рекомбинантные штаммы, трансформированные плазмидой pLacDualIL10/IL22. Культивирование проводили в стеклянном биореакторе (рабочий объем 600 мл) с автоматическим контролем pH, температуры и растворенного кислорода. Реализован трехэтапный режим: фаза роста (37°C, pH 6,8), фаза индукции (1 мМ IPTG, 30°C) и фаза продукции. Очистку белков проводили тангенциальной ультрафильтрацией и аффинной хроматографией на Ni-NTA агарозе. Количественный анализ IL-10 и IL-22 выполняли методом ELISA, чистоту оценивали с помощью SDS-PAGE, биологическую активность – в пролиферативном тесте на лимфоцитах PBMC. Применение стратегии, включающей фазы роста, индукции (1 мМ IPTG, 30°C) и продукции, позволило достичь значительного увеличения выхода целевых белков: до 120±15 мг/л для IL-10 и 95±10 мг/л для IL-22, что в 2—3 раза превышает показатели при культивировании в колбах. Последующая очистка методом тангенциальной ультрафильтрации и аффинной хроматографии обеспечила получение белков высокой степени чистоты >95 % и >93 %, соответственно с сохраненной биологической активностью 1,2×106 ЕД/мг для IL-10 и 8,5×105 ЕД/мг для IL-22. Предложенная методика демонстрирует высокую воспроизводимость и эффективность, что подтверждает ее перспективность для масштабируемого производства функциональных рекомбинантных цитокинов на пробиотической платформе.
The development of high-performance probiotic strains capable of synthesizing therapeutic proteins requires an integrated approach combining genetic engineering with optimization of fermentation conditions. In this study, an improved three-stage cultivation protocol for a recombinant Lactobacillus spp. strain co-expressing interleukins IL-10 and IL-22 was developed and validated in a bioreactor with automatic control of critical parameters, including pH, temperature, and dissolved oxygen. Recombinant strains transformed with the pLacDualIL10/IL22 plasmid were used. Cultivation was performed in a glass bioreactor (working volume 600 mL) equipped with automated monitoring and regulation of pH, temperature, and dissolved oxygen. A three-stage режим was implemented, consisting of a growth phase (37°C, pH 6.8), an induction phase (1 mM IPTG, 30°C), and a production phase. Protein purification was carried out by tangential flow ultrafiltration followed by affinity chromatography on Ni-NTA agarose. Quantitative determination of IL-10 and IL-22 was performed using ELISA; purity was assessed by SDS-PAGE, and biological activity was evaluated using a PBMC lymphocyte proliferation assay. Application of the three-stage strategy resulted in a significant increase in target protein yield, reaching 120±15 mg/L for IL-10 and 95±10 mg/L for IL-22, which is 2—3 times higher than that achieved in flask cultivation. Subsequent purification provided high-purity proteins (>95 % and >93 %, respectively) with preserved biological activity of 1,2×106 U/mg for IL-10 and 8,5 × 105 U/mg for IL-22. The proposed methodology demonstrates high reproducibility and efficiency, confirming its potential for scalable production of functional recombinant cytokines using a probiotic platform.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.