ivmМеждународный вестник ветеринарииInternational Journal of Veterinary Medicine2072-2419SpbGUVM Publishing Houseivm-718Research ArticleИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИINFECTIOUS DISEASESРазработка способа одновременной идентификации возбудителей лей-коза и иммунодефицита крупного рогатого скотаDevelopment of a method for simultaneous identification of causes of leuke-mia and immunodeficiency of cattleУсольцевК. В.UsoltsevK. V.

канд. вет. наук, вед. науч. сотр.

ГорбуноваМ. Е.FaizovT. Kh.

мл. науч. сотр.

СафинаР. Ф.GorbunovaM. E.

асп.

ШангараевР. И.SafinaR. F.

канд. вет. наук, мл. науч. сотр.

СальмановаГ. Р.ShangaraevR. I.

асп.

ОсянинК. А.SalmanovaG. R.

канд. биол. наук, зав. отд. биохимии и генетического анализа

ФаизовТ. Х.OsyaninK. A.

д-р вет. наук, зав. лаб. молекулярно-генетического анализа

ХаммадовН. И.KhammadovN. I.

канд. биол. наук, вед. науч. сотр.

ФГБНУ «Федеральный центр радиационной, токсикологической и биологической безопасности»РоссияFederal State Budgetary Scientific Institute “Federal Center for Toxicological, Radiation, and Biological Safety”Russian Federation202112102021034654Copyright © Усольцев К.В., Горбунова М.Е., Сафина Р.Ф., Шангараев Р.И., Сальманова Г.Р., Осянин К.А., Фаизов Т.Х., Хаммадов Н.И., 20212021Усольцев К.В., Горбунова М.Е., Сафина Р.Ф., Шангараев Р.И., Сальманова Г.Р., Осянин К.А., Фаизов Т.Х., Хаммадов Н.И.Usoltsev K.V., Faizov T.K., Gorbunova M.E., Safina R.F., Shangaraev R.I., Salmanova G.R., Osyanin K.A., Khammadov N.I.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://vetjournal.spbguvm.ru/jour/article/view/718

Статья описывает процесс разработки способа одновременной генетической идентификации нуклеиновых кислот вирусов лейкоза (ВЛ) и иммунодефицита (ВИ) крупного рогатого скота (КРС). При создании данного способа были использованы ранее разработанные праймерные комбинации к провирусным ДНК ВЛ КРС, ВИ КРС и ДНК КРС. Для контроля амплификации были созданы два положительных контрольных образца (ПКО), представляющие собой рекомбинантные генетические конструкции на основе плазмиды pALT2 со встроенными специфичными нуклеотидными последовательностями участков провирусной ДНК ВЛ КРС и ВИ КРС. Подобран оптимальный температурно-временной режим и экспериментально доказана его работоспособность. Методом десятикратных разведений рекомбинантных плазмид, несущих специфичные гены ВЛ КРС и ВИ КРС, определена минимальная чувствительность, которая составила 1 – 3 молекул ДНК в 1 мкл реакционной смеси для генов обоих возбудителей. Также в результате проведения ПЦР с образцами гетерогенной и гомогенной ДНК доказана высокая специфичность разработанного способа. Практическая значимость и работоспособность разработанного способа подтверждены исследованиями образцов крови КРС, полученных от больных и здоровых животных, из животноводческих хозяйств неблагополучных по лейкозу. Предложенный способ позволяет одной реакцией и в одной реакционной смеси обнаруживать и идентифицировать провирусную ДНК ВЛ КРС и ВИ КРС одновременно.

The article describes the process of design method one-time indication and identification of pathogens of bovine leukemia virus (BLV) and bovine immunodeficiency virus (BIV) by polymerase chain reaction in real time. For creation this method, early designed primers combination was used to detect provirus DNA BLV and BIV. For the purpose of control amplification two positive control samples (PCS) were created, which are recombinant genetic constructs based on the pALT2 plasmid with embedded specific nucleotide sequences of sections of provirus DNA BLV and BIV. The optimal temperature - time mode has been selected for created test system, and its operability has been proved experimentally. Minimum sensitivity was determined by method ten-fold dilutions of recombinant plasmids which carry specific genes BLV and BIV. The latest was 1-3 DNA molecules in 1 µl reaction mixture for the genes of both pathogens. Designed method was proved high specificity, according to result of PCR with heterogeneous and homogeneous DNA samples. The practical significance and performance of created method are confirmed by studies of blood samples obtained from sick and healthy animals, from farms that are infected by leukemia virus. Designed method allows simultaneously detecting provirus DNA of BLV and BIV one-time in one reaction mixture.

возбудитель лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС)возбудитель иммунодефицита крупного рогатого скота (ВИ КРС)полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ)энзоотический лейкоздезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК)геномbovine leukemia virus (BLV)bovine immunodeficiency virus (BIV)real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)enzootic leukemiadeoxyribonucleic acid (DNA)genomeReferencesАгольцов В.А. Сравнительная диагностическая оценка серологического и молекулярно-генетического методов лабораторных исследований на лейкоз крупного рогатого скота / В.А. Агольцов, Е.С. Красникова, А.А. Щербаков, П.С. Мелкина, Е.А. Горельникова, Н.А. Дружаева // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2012. - № 4 (90). - C. 56-59.Агольцов В.А. Сравнительная диагностическая оценка серологического и молекулярно-генетического методов лабораторных исследований на лейкоз крупного рогатого скота / В.А. Агольцов, Е.С. Красникова, А.А. Щербаков, П.С. Мелкина, Е.А. Горельникова, Н.А. Дружаева // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2012. - № 4 (90). - C. 56-59.Апалькин В.А., Гулюкин М.И., Петров Н.И. Лейкоз крупного рогатого скота. - СПб.: Петролазер, 2005. - 105 с.Апалькин В.А., Гулюкин М.И., Петров Н.И. Лейкоз крупного рогатого скота. - СПб.: Петролазер, 2005. - 105 с.Байсеитов С.Т., Новикова Н.Н., Власенко В.С., Красиков А.П. Сравнительная оценка диагностической эффективности РИД, ИФА и РНИФ при лейкозе крупного рогатого скота. Вестник Омского государственного аграрного университета. 2020. № 1 (37). С. 97-102.Байсеитов С.Т., Новикова Н.Н., Власенко В.С., Красиков А.П. Сравнительная оценка диагностической эффективности РИД, ИФА и РНИФ при лейкозе крупного рогатого скота. Вестник Омского государственного аграрного университета. 2020. № 1 (37). С. 97-102.Козырева Н.Г., Иванова Л.А., Степанова Т.В., Гулюкин М.И. Лабораторные испытания разработанной мультиплексной ПЦР-РВ при диагностике лейкоза крупного рогатого скота у молодняка. Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» № 1(29), 2019.Козырева Н.Г., Иванова Л.А., Степанова Т.В., Гулюкин М.И. Лабораторные испытания разработанной мультиплексной ПЦР-РВ при диагностике лейкоза крупного рогатого скота у молодняка. Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» № 1(29), 2019.Красникова Е.С. Анализ аминокислотного состава молока коров, инфицированных ретровирусами / Е.С. Красникова, А.В. Банникова, А.В. Евтеев, Г.Х. Утанова. // В сборнике: Актуальные проблемы ветеринарной хирургии, онкологии и терапии. - 2016. - С. 87-92.Красникова Е.С. Анализ аминокислотного состава молока коров, инфицированных ретровирусами / Е.С. Красникова, А.В. Банникова, А.В. Евтеев, Г.Х. Утанова. // В сборнике: Актуальные проблемы ветеринарной хирургии, онкологии и терапии. - 2016. - С. 87-92.Красникова Е.С. Оценка качества молока, полученного от инфицированных ретровирусами коров, и определение способов его переработки / Е.С. Красникова, Г.Х. Утанова, Н.А. Федосов, А.А. Щербаков // Научное обозрение. 2015. - № 17. - С. 10-15.Красникова Е.С. Оценка качества молока, полученного от инфицированных ретровирусами коров, и определение способов его переработки / Е.С. Красникова, Г.Х. Утанова, Н.А. Федосов, А.А. Щербаков // Научное обозрение. 2015. - № 17. - С. 10-15.Красникова, Е.С. Эпизоотическая ситуация по ретровирусным инфекциям животных в Саратовской области и оптимизация лабораторной диагностики / Е.С. Красникова, В.А. Агольцов, О.Е. Семенова // Современные технологии в ветеринарии зоотехнии. Творческое наследие В.К. Бирха: мат. Междунар. науч.-практич. конф. – Пермь. 2013. – С. 100-106.Красникова, Е.С. Эпизоотическая ситуация по ретровирусным инфекциям животных в Саратовской области и оптимизация лабораторной диагностики / Е.С. Красникова, В.А. Агольцов, О.Е. Семенова // Современные технологии в ветеринарии зоотехнии. Творческое наследие В.К. Бирха: мат. Междунар. науч.-практич. конф. – Пермь. 2013. – С. 100-106.Криворучко, С.В. Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота в хозяйствах Ставропольского края / С.В. Криворучко, С.С. Абакин, Г.А. Дубравная // Ветеринарная патология. - 2012. - № 2 (40). - С. 35-38.Криворучко, С.В. Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота в хозяйствах Ставропольского края / С.В. Криворучко, С.С. Абакин, Г.А. Дубравная // Ветеринарная патология. - 2012. - № 2 (40). - С. 35-38.Никитин А.И., Усольцев К.В., Фаизов Т.Х., Чернов А.Н., Усольцева И.И., Семенова М.Е., Хаммадов Н.И., Алеева З.З., Хусниев Ф.А., Ахмадеев Р.М., Валидов Ш.З., Шуралев Э.А. Способ экспрессдиагностики лейкоза крупного рогатого скота. Патент на изобретение RU 2644233 C2, 08.02.2018. Заявка № 2016109396 от 15.03.2016.Никитин А.И., Усольцев К.В., Фаизов Т.Х., Чернов А.Н., Усольцева И.И., Семенова М.Е., Хаммадов Н.И., Алеева З.З., Хусниев Ф.А., Ахмадеев Р.М., Валидов Ш.З., Шуралев Э.А. Способ экспрессдиагностики лейкоза крупного рогатого скота. Патент на изобретение RU 2644233 C2, 08.02.2018. Заявка № 2016109396 от 15.03.2016.Сафина Р.Ф. Повышение чувствительности и специфичности ПЦР с использованием ДНК-маркеров, кодирующих белки p24 и gp51, в ПЦР-РВ для индикации ВЛКРС / Сафина Р.Ф., Лукманова Г.Р., Усольцев К.В., Хаммадов Н.И., Фаизов Т.Х. // Ветеринарный врач. - 2019. - № 2. - С. 8-14.Сафина Р.Ф. Повышение чувствительности и специфичности ПЦР с использованием ДНК-маркеров, кодирующих белки p24 и gp51, в ПЦР-РВ для индикации ВЛКРС / Сафина Р.Ф., Лукманова Г.Р., Усольцев К.В., Хаммадов Н.И., Фаизов Т.Х. // Ветеринарный врач. - 2019. - № 2. - С. 8-14.Сюрин В.Н., Самуйленко А Я., Соловьёв Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. – М.: ВНИТИБП, 2001. - 446 c.Сюрин В.Н., Самуйленко А Я., Соловьёв Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. – М.: ВНИТИБП, 2001. - 446 c.Усольцев К.В. Способ одновременной экспресс диагностики лейкоза и вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота на основе метода мультиплексной ПЦР / К.В. Усольцев, Н.И. Хаммадов, К.А. Осянин, Т.Х. Фаизов // В книге: Физико-химическая биология как основа современной медицины тезисы докладов участников Республиканской конференции с международным участием, посвященной 110-летию со дня рождения В. А. Бандарина. Белорусский государственный медицинский университет. - 2019. - С. 122-123.Усольцев К.В. Способ одновременной экспресс диагностики лейкоза и вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота на основе метода мультиплексной ПЦР / К.В. Усольцев, Н.И. Хаммадов, К.А. Осянин, Т.Х. Фаизов // В книге: Физико-химическая биология как основа современной медицины тезисы докладов участников Республиканской конференции с международным участием, посвященной 110-летию со дня рождения В. А. Бандарина. Белорусский государственный медицинский университет. - 2019. - С. 122-123.Утанова, Г.Х. Молекулярногенетическая диагностика вируса бычьего иммунодефицита / Г.Х Утанова, А.П. Силаев // Сборник трудов IХ Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА 2017» / Под редакцией академика РАН В.И. Покровского. - ТОМ II. – МОСКВА, 2017. - С. 407 – 408.Утанова, Г.Х. Молекулярногенетическая диагностика вируса бычьего иммунодефицита / Г.Х Утанова, А.П. Силаев // Сборник трудов IХ Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА 2017» / Под редакцией академика РАН В.И. Покровского. - ТОМ II. – МОСКВА, 2017. - С. 407 – 408.Хаммадов Н.И. Генетические маркеры вируса ящура крупного рогатого скота, геномный анализ // Проблемы особо опасных инфекций. - 2019. - № 2. - С. 111-116.Хаммадов Н.И. Генетические маркеры вируса ящура крупного рогатого скота, геномный анализ // Проблемы особо опасных инфекций. - 2019. - № 2. - С. 111-116.Bazargani T.T. The first survey on the status of the bovine immunudeficiency virus infection and associated clinical, pathological, haematological and flow cytometric findings in holestein cattle in Iran / T.T. Bazargani, M. Tooloei, G.N. Broujeni, M.J. Garagozlo, S. Bokaei, M. Khormali, N. Barjaste // Journal of Veterinary Research. – 2010. - №65. – P.1–12.Bazargani T.T. The first survey on the status of the bovine immunudeficiency virus infection and associated clinical, pathological, haematological and flow cytometric findings in holestein cattle in Iran / T.T. Bazargani, M. Tooloei, G.N. Broujeni, M.J. Garagozlo, S. Bokaei, M. Khormali, N. Barjaste // Journal of Veterinary Research. – 2010. - №65. – P.1–12.Carpenter S. Characterization of early pathogenic effects after experimental infection of calves with bovine immunodeficiency-like virus. / Carpenter S., Miller L.D., Alexandersen S., Whetstone C.A., Van Der Maaten M.J., Viuff B., Wannemuehler Y., Miller J.M., Roth J.A. // J. Virol. 1992; 66:1074–83.Carpenter S. Characterization of early pathogenic effects after experimental infection of calves with bovine immunodeficiency-like virus. / Carpenter S., Miller L.D., Alexandersen S., Whetstone C.A., Van Der Maaten M.J., Viuff B., Wannemuehler Y., Miller J.M., Roth J.A. // J. Virol. 1992; 66:1074–83.Egberink H. Animal immunodeficiency viruses / H. Egberink, M.C Horzinek. // Veterinary Microbiology. – 1992. - №33. – P.311-331.Egberink H. Animal immunodeficiency viruses / H. Egberink, M.C Horzinek. // Veterinary Microbiology. – 1992. - №33. – P.311-331.González-Fernández V.D. First evidence of bovine immunodeficiency virus infection in Mexican cattle / V.D. GonzálezFernández, J.L. Tórtora Pérez, M.M. García Flores, J.Á. Aguilar Setién, H. Ramírez Álvarez // Transboundary and Emerging Diseases. - 2020.González-Fernández V.D. First evidence of bovine immunodeficiency virus infection in Mexican cattle / V.D. GonzálezFernández, J.L. Tórtora Pérez, M.M. García Flores, J.Á. Aguilar Setién, H. Ramírez Álvarez // Transboundary and Emerging Diseases. - 2020.Pablo-Maiso L. Prospects in innate immune responses as potential control strategies against non-primate lentiviruses / L. Pablo-Maiso, A. Doménech, I. Echeverría, C. Gómez-Arrebola, D. de Andrés, S. Rosati, E. Gómez-Lucia, R. Reina // Viruses. – 2018. - №10 (8). – P. 435.Pablo-Maiso L. Prospects in innate immune responses as potential control strategies against non-primate lentiviruses / L. Pablo-Maiso, A. Doménech, I. Echeverría, C. Gómez-Arrebola, D. de Andrés, S. Rosati, E. Gómez-Lucia, R. Reina // Viruses. – 2018. - №10 (8). – P. 435.Snider T.G. Natural and experimental bovine immunodeficiency virus infection in cattle. / Snider T.G., Hoyt P.G., Jenny B.F., Coats K.S., Luther D.G., Storts R.W., Battles J.K., Gonda M.A. // Vet Clin North Am Food Anim Pract. 1997 Mar; 13(1):151-76. Review.Snider T.G. Natural and experimental bovine immunodeficiency virus infection in cattle. / Snider T.G., Hoyt P.G., Jenny B.F., Coats K.S., Luther D.G., Storts R.W., Battles J.K., Gonda M.A. // Vet Clin North Am Food Anim Pract. 1997 Mar; 13(1):151-76. Review.Отчёт по эпизоотической ситуации в Российской Федерации за 2019 г. Официальный сайт Россельхознадзора (https://fsvps.gov.ru/fsvps-docs/ru/iac/rf/2019/iac2019.pdfОтчёт по эпизоотической ситуации в Российской Федерации за 2019 г. Официальный сайт Россельхознадзора (https://fsvps.gov.ru/fsvps-docs/ru/iac/rf/2019/iac2019.pdfВетеринарные правила осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов лейкоза крупного рогатого скота (Зарегистрировано в Министерстве юстиции Российской Федерации 29 апреля 2021 года, регистрационный N 63300). https://docs.cntd.ru/document/603433105?marker=6540INВетеринарные правила осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов лейкоза крупного рогатого скота (Зарегистрировано в Министерстве юстиции Российской Федерации 29 апреля 2021 года, регистрационный N 63300). https://docs.cntd.ru/document/603433105?marker=6540INРасчётные онлайн-формы для конверсии массы в моли. Интернет ресурс MolBiol.ru. http://molbiol.ru/scripts/01_07.htmlРасчётные онлайн-формы для конверсии массы в моли. Интернет ресурс MolBiol.ru. http://molbiol.ru/scripts/01_07.htmlТаксономическая классификация NCBI: txid11646. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=11646&lvl=3&lin=f&keep=1&srchmode=1&unlockТаксономическая классификация NCBI: txid11646. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=11646&lvl=3&lin=f&keep=1&srchmode=1&unlockМеждународный комитет по таксономии вирусов (ICTV). https://talk.ictvonline.org/taxonomy/Международный комитет по таксономии вирусов (ICTV). https://talk.ictvonline.org/taxonomy/Онлайн-утилита BLAST интернетресурса NCBI https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthomeОнлайн-утилита BLAST интернетресурса NCBI https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthomeФГБНУ «Федеральный центр радиационной, токсикологической и биологической безопасности» Научный Городок2, Казань, Республика Татарстан, 422701.ФГБНУ «Федеральный центр радиационной, токсикологической и биологической безопасности» Научный Городок2, Казань, Республика Татарстан, 422701.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.