Получение и определение серологической активности рекомбинантного О-антигена бруцелл, синтезированного в эукариотической системе экспрессии

Бруцеллез представляет собой опасное зоонозное заболевание, вызываемое бактериями рода Brucella, которое оказывает существенное негативное влияние на продуктивность сельскохозяйственных животных. В Российской Федерации успехи в борьбе с данным заболеванием у крупного рогатого скота связаны с использованием вакцины, созданной на основе штамма Brucella abortus 82, а также своевременным выявлением инфицированных животных. Настоящая работа посвящена получению и изучению серологической активности рекомбинантного О-антигена для индикации антител против бруцеллеза. В результате проведения поисковых запросов в базе данных GenBank нами идентифицирована аминокислотная последовательность О-полисахаридного антигена бруцелл – WP_002967174.1. Данную последовательность оптимизировали для трансляции белка на культуре клеток млекопитающих, синтезировали и клонировали в плазмиду pVAX1. Наработку pVAX1 проводили путем трансформации клеток Escherichia coli штамма DH5α методом теплового шока, с селекцией по гену устойчивости к канамицину с дальнейшим выделением и очисткой плазмидной ДНК. Трансфекция клеток HEK293 полу ченной генетической конструкцией приводила к экспрессии целевого антигена, факт наличия которого в жидкости, отобранной с клеточной культуры, установили с помощью вертикального электрофореза в 12 % ПААГ по результату визуализации мажорных паттернов на уровне 70 кДа. В результате ионообменной и гель-фильтрационной хроматографии удалось получить очищенный О-антиген в растворенном виде в концентрации 4,7 мг/мл. Полученный препарат был применен в разведении 10 мкг/мл, в качестве антигена, при проведении непрямого твердофазного ИФА для индикации антител в сыворотках крови крупного рогатого скота против S и R антигена бруцелл. Коэффициент специфичности рассчитывали относительно данных ИФА с сывороткой крови в разведении 1:256. Так при реакции с сывороткой крови крупного рогатого скота против Brucella abortus коэффициент специфичности составил 6,29, против S и R антигенов бруцелл – 6,1 и 6.77 соответственно. Результаты исследования могут внести значительный вклад в развитие методов диагностики и лечения бруцеллеза, а также в создание новых вакцинных препаратов.

1. Насибуллин Р.Ю. Применение пеногасителей при глубинном культивировании бруцелл. Ветеринарный врач. 2023; 4:33- 37. https://doi.org/10.33632/1998-698X_2023_4_33.

2. Булашев А.К., Акибеков О.С., Сыздыкова А.С., Сураншиев Ж.А., Ескендирова С.З. Cерологический потенциал рекомбинантных белков Brucella spp. в диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота. Вестник НГАУ (Новосибирский государственный аграрный университет). 2020; 1 (54):56-64. https://doi.org/10.31677/2072-6724-2020-54-1-56-64

3. Анисимова Е.А., Миргазов Д.А., Додонова Е.А., Елизарова И.А., Панкова Е.В., Осянин К.А. Применение HRM-анализа кривых плавления, полученных после амплификации VNTR-локусов, для идентификации и дифференциации штаммов бруцелл. Проблемы особо опасных инфекций. 2023; 4:42-49. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2023-4-42-49

4. Пономаренко Д.Г., Матвиенко А.Д., Хачатурова А.А., Жаринова И.В., Скударева О.Н., Транквилевский Д.В., Логвиненко О.В., Ракитина Е.Л., Костюченко М.В., Кондратьева Ю.В., Малецкая О.В., Куличенко А.Н. Анализ ситуации по бруцеллезу в мире и Российской Федерации. Проблемы особо опасных инфекций. 2024; 2:36-50. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2024-2-36-50

5. Громова Е.А., Миргазов Д.А., Додонова Е.А., Елизарова И.А., Горбунова М.Е., Осянин К.А. Разработка мультиплексной ПЦР-РВ тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза. Ветеринарный врач. 2024; 3:34-40. https://doi.org/10.33632/1998-698X_2024_3_34

6. Булашев А.К., Акибеков О.С., Сыздыкова А., Сураншиев Ж.А., Инербай Б. Сравнительная оценка белков внешней мембраны Brucella в серодиагностике бруцеллеза. Актуальная биотехнология. 2020; 3 (34):86-90

7. Zygmunt M.S., Bundle D.R., Ganesh N.V., Guiard J., Cloeckaert A. Monoclonal Antibody-Defined Specific C Epitope of Brucella O-Polysaccharide Revisited. Clin Vaccine Immunol. 2015; 22(8):979-82. https://doi.org/10.1128/CVI.00225-15

8. Усольцев К.В., Горбунова М.Е., Шангараев Р.И., Зайнуллин Л.И., Хаертынов К.С., Осянин К.А., Хаммадов Н.И. Применение синтетического пептида на основе иммуногенного эпитопа GP51 для серологической диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота. Международный вестник ветеринарии. 2024; 1:12-21. https://doi.org/10.52419/issn2072-2419.2024.1.12

9. Mirkalantari S., Zarnani A., Nazari M., Irajian G.R., Amirmozafari N. Brucella melitensis VirB12 recombinant protein is a potential marker for serodiagnosis of human brucellosis. Ann Clin. Microbiol. Antimicrob. 2017; 8 (16). https://doi.org/10.1186/s12941-017-0182-4

10. Ahmed I., Khairani-Bejo S., Hassan L. Serological diagnostic potential of outer membrane proteins (rOMPs) from Brucella melitensis in mouse model using indirect enzyme-linked immunosorbent assay. BMC Veterinary Research. 2015; І. (11): 275

11. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E. Current Protocols in Molecular Biology Copyright. John Wiley&Sons, 2003. 4755 р

12. Tian M., Li X., Yu L., Qian J., Bai X., Yang J., Deng R., Lu C., Zhao H., Liu Y. Glycosylation as an intricate post translational modification process takes part in glycoproteins related immunity. Cell Commun Signal. 2025; 5:23(1):214. https://doi.org/10.1186/s12964-025-02216-w