Способ количественного определения вирусных нуклеиновых кислот для стандартизации условий производства интраназальной вакцины против респираторных болезней новорожденных телят

Основными критериями оценки вакцин являются их иммуногенность, специфическая активность и безопасность. Целью данной работы являлась разработка ПЦР в реальном времени для выявления и количественной оценки вирусных нуклеиновых кислот для стандартизации условий производства интраназальной вакцины против респираторных болезней новорожденных телят. Сконструированы комбинации праймеров и зондов (для каждого патогена индивидуально) позволяющие идентифицировать участок гликопротеина G респираторносинцитиального вируса (РСВ) размером 97 п.н. расположенного в области от 4849 до 4945 п.н.; участок 130 п.н P-гена возбудителя ПГ-3 в области от 2856 до 2985 п.н.; локус 171 п.н вируса ИРТ в области от 8271 по 8341 п.н.. Создан и синтезирован положительный контрольный образец (ПКО), представляющий собой замкнутую в кольцо двухцепочную молекулу ДНК (5618 п.н.), содержащую нуклеотидную последовательность, состоящую из сконструированных праймеров и зондов для индикации вирусов ИРТ, ПГ-3 и РСИ. С использованием ПКО определены оптимальные условия постановки количественной ПЦР-РВ и состав реакционной смеси. Минимальная концентрация плазмидной ДНК, при которой регистрировалась успешная амплификация составила 5 аг/мкл, что соответствовало разведению 10-10, при котором в 1 мл раствора содержалось 826 молекул плазмидной ДНК. По результатам амплификации вируссодержащего материала установлены следующие концентрации патогенов: ИРТ – 0,7-1,5 млн копий ДНК/мл, ПГ-3 – 0,1-0,5 млн копий РНК/мл и РСВ – 20-80 тыс. копий РНК/мл. Разработанный способ определения количественного содержания вирусных НК на основе ПЦР-РВ благодаря своим характеристикам является перспективным подходом при организации производства вакцины для профилактики респираторных инфекций молодняка, а также обеспечивает соответствие конечного продукта стандартам качества.

1. Акбашев И.Р., Садыкова С.В., Яшагина Л.М., Каримуллина И.Г., Хусаинова Г.И., Гумеров В.Г., Евстифеев В.В. Изучение антигенных свойств ассоциированной вакцины против ИРТ, ВД-БС, ПГ-3 и хламидиоза крупного рогатого на кроликах. Ветеринарный врач. 2024; 2: С. 39–42. https://doi.org/10.33632/1998-698X_2024_2_39

2. Karimullina I., Yarullin A., Mukhammadiev R., Mukhammadiev R., Mingaleev D., Khusainova G., Sorokina D., Gumerov V. Optimization of conditions for cultivation of pathogens of infectious rhinotracheitis and viral diarrhea. Bio web of conferences. 2024; 116: 06012. https://doi.org/10.1051/bioconf/202411606012

3. Красочко П.А., Яромчик Я.П., Красочко И.А., Красочко П.П., Машеро В.А., Понаськов М.А., Притыченко А.В., Кучинский М.П. Оценка антигенной активности аттенуированных штаммов вирусов, используемых для изготовления вакцин для животных. Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак почета государственная академия ветеринарной медицины. 2022; 58(4): 2-57. https://doi.org/10.52368/2078-0109-2022-58-4-52-57.

4. Valas S., Ngwa-Mbot D., Stourm S., Mémeteau S., Tabouret M. A retrospective evaluation of pooled serum ELISA testing in the frame of the French eradication program for infectious bovine rhinotracheitis. Preventive Veterinary Medicine. 2023; 214: 105890. https://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2023.105890

5. Barber K.A., Daugherty H.C., Ander S.E., Jefferson V.A., Shack L.A., Pechan T.., Nanduri B, Meyer F. Protein composition of the bovine herpesvirus 1.1 virion. Vet. Sci. 2017; 4(1): 11. https://doi.org/10.3390/vetsci4010011

6. Rimayanti R., Khairullah A.R., Lestari T.D., Moses I.B., Utama S., Damayanti R., Mulyati S., Raharjo H.M., Kusala MKJ, Raissa R., Wibowo S., Abdila S.R., Fauzia K.A., Yanestria S..M, Fauziah I., Siregar J.E. Infectious bovine rhinotracheitis: Unveiling the hidden threat to livestock productivity and global trade. Open Vet J. 2024; 14(10): 2525-2538. https://doi.org/10.5455/OVJ.2024.v14.i10.3

7. Галиуллин А.К., Гумеров В.Г., Гильмутдинов Р.Я., Шаева А.Ю., Гериш Ашуак, Магдеева Э.А., Софронов П.В. Молекулярно-генетический анализ геномов вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота. Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2023; 255(3): 92-99. https://doi.org/10.31588/2413_4201_1883_2_255_92.

8. Коровкин А.С., Горенков Д.В., Волгин А.Р. Профилактика респираторносинцитиальной вирусной инфекции: современное состояние и перспект ивы разработки вакцин. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2024;24 (3):255–269. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2024-24-3-255-26

9. West K., Petrie L., Konoby C., Haines D.M., Cortese V., Ellis J.A. The efficacy of modified-live bovine respiratory syncytial virus vaccines in experimentally infected calves. Vaccine. 1999; 18: 907–919. https://doi.org/10.1016/s0264-410x(99)00324-2.

10. Xue W., Ellis J., Mattick D., Smith L., Brady R., Trigo E. Immunogenicity of a modified-live virus vaccine against bovine viral diarrhea virus types 1 and 2, infectious bovine rhinotracheitis virus, bovine parainfluenza-3 virus, and bovine respiratory syncytial virus when administered intranasally in young calves. Vaccine.2010; 28 (22): Р. 3784-3792. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2010.03.043

11. Hill K.L., Hunsaker B.D., Townsend H.G., Griebel P.J. Mucosal immune response in newborn Holstein calves that had maternally derived antibodies and were vaccinated with an intranasal multivalent modified-live virus vaccine. J. Am. Vet. Med. Assoc. 2012; 240: 1231–1240. https://doi.org/10.2460/javma.240.10.1231

12. Chamorro M.F., Palomares R.A. Bovine respiratory disease vaccination against viral pathogens. Modified-live versus inactivated antigen vaccines, intranasal versus parenteral, what is the evidence? Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 2020; 36: 461–472. https://doi.org/10.1016/j.cvfa.2020.03.006

13. McNeff C.A., Robison C.A., Wilson B.K., White F.J., Cauble R., Biggs R., SalakJohnson J.L., Beck P.A. Modified-live versus inactivated respiratory viral vaccines for revaccinating beef calves at weaning. Applied Animal Science. 2023; 39 (1): 1-13.

14. Хаммадов Н.И., Горбунова М.Е., Сальманова Г.Р., Фахрутдинов Н.А., Гулюкин А.М., Галеева А.Г., Громова Е.А. Конструирование специфических праймеров для ПЦР- диагностики классической чумы. Ветеринарный врач. 2024; 3:41-46. https://doi.org/ 10.33632/1998-698X_2024_3_41

15. Усольцев К.В., Шангараев Р.И., Хаертынов К.С., Горбунова М.Е., Хаммадов Н.И., Осянин К.А., Хамидуллина А.И. Дизайн праймеров для индикации патогенных лептоспир методом гнездовой полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2025; 2:95-106. https://doi.org/10.36871/vet.zoo.bio.202502111

16. Хаммадов Н.И., Горбунова М.Е., Ефимова М.А., Усольцев К.В., Сальманова Г.Р., Шангараев Р.И., Тарасова Е.Ю. Дизайн специфических олигонуклеотидов для выявления контаминации культур клеток возбудителем вирусной диареи и микоплазмами при разработке интраназальной вакцины против респираторных болезней новорожденных телят. Ветеринарный врач. 2025; 3: 98-104. https://doi.org/10.33632/1998-698X_2025_3_98

17. Reed L., Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Epidemiology. 1938; 27(3): 493-497.

18. Кривицкая В.З., Синцова К.С., Петрова Е.Р., Сверлова М.В., Сорокин Е.В., Царева Т.Р., Комиссаров А.Б., Фадеев А.В., Писарева М.М., Бузицкая Ж.В., Афанасьева В.С., Суховецкая В.Ф., Соминина А.А. Генетическая и антигенная характеристика штаммов респираторно синцитиального вируса, выделенных в Санкт-Петербурге в 2013-2016 гг. Вопросы вирусологии. 2017; 62(6): 273-282. http://dx.doi.org/10.18821/0507-4088-2017-62-6-273-282

19. Ren Y., Chen X., Tang C.,Yue H. First isolation and characterization of a bovine parainfluenza virus type 3 genotype C strain from an aborted Holstein fetus. Front. Vet. Sci. 2025; 12:1598013. http://dx.doi.org/10.3389/fvets.2025.1598013.