Эндогенные контроли амплификации при индикации инфекционных заболеваний крупного и мелкого рогатого скота

Для достоверной интерпретации результатов ПЦР необходимо использовать: положительный, отрицательный и внутренний контроль. Внутренний контроль может быть двух видов: экзогенный, подразумевает дополнительное внесение в анализируемый образец (при выделении ДНК или РНК) нуклеиновых кислот для гибридизации праймеров для внутреннего контроля амплификации и эндогенный, когда нуклеиновые кислоты для контроля уже присутствуют в самом образце. Данное исследование посвящено анализу невидоспецифичных генов крупного рогатого скота, овец и коз и поиску консервативных локусов, которые можно применить для внутреннего контроля амплификации при выявлении нуклеиновых кислот возбудителей инфекционных заболеваний крупного и мелкого рогатого скота. Для дизайна олигонуклеотидов были отобраны гены крупного и мелкого рогатого скота, а именно: бета-галактозидазы, гиалуронидазы, диацилглицерол О-ацилтрансферазы, каппа-казеина, лактоферрина, нейраминидазы, окситоцина и фосфорилаз киназы. Учитывая нуклеотидный полиморфизм невидоспецифичных генов крупного рогатого скота, овец и коз, удалось определить наиболее консервативные локусы анализируемых генов для целевых животных, подходящие для дизайна соответствующих праймеров и зондов. Сопоставив различия в нуклеотидной последовательности всего гена и его экзонов для каждого гена, удалось определить наиболее консервативные локусы экзонов двух из анализируемых генов, подходящие для дизайна соответствующих праймеров и зондов. В результате выравнивания нуклеотидных последовательностей для каждого гена, был определен избыточный нуклеотидный полиморфизм у разных животных при совместном выравнивании нуклеотидной последовательности всего гена и его экзонов. Однако при выравнивании лишь экзонов анализируемых генов наблюдается множество консервативных локусов, пригодных для дизайна соответствующих олигонуклеотидов. В качестве внутреннего контроля при ОТ-ПЦР предложены олигонуклеотиды, комплиментарные экзонам генов бета-галактозидазы и нейраминидазы.

1. Ивойлов О. О., Кочетов А. Г., Мининкова А. И. Анализ и моделирование трудозатрат персонала медицинской лаборатории при осуществлении ПЦР-тестирования на РНК SARS-CoV-2: фотохронометражное исследование. Российский медицинский журнал. 2022; 28(2):103—117. DOI: 10.17816/medjrf108935.

2. Нефедченко А. В., Котенева С. В. и др. Выявление пестивирусов крупного рогатого скота при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Вопросы вирусологии. 2020; 65(2):95—102. DOI: 10.36233/0507-4088-2020-65-2-95-102.

3. Черепушкина В. С., Сысоева О. Е. и др. Изучение случаев микозов у цыплят—бройлеров в Западно-Сибирском регионе в 2022 году с использованием различных методов диагностики Птицеводство. 2024; 2:44—50. DOI: 10.33845/0033-3239-2024-73-2-44-50.

4. Федорович С. В., Супрун И. И., Упадышев М. Т. Разработка метода мультиплексной идентификации вируса шарки сливы и гена большой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/ оксигеназы как внутреннего положительного контроля амплификации. Плодоводство и виноградарство Юга России. 2023; 81(3):279—289. DOI: 10.30679/2219-5335-2023-3-81-279-289.

5. Федосеева Л. А., Шевелев О. Б., Колосова Н. Г., Дымшиц Г. Ш. Рибонуклеопротеиновые частицы фага MS2 как экзогенный внутренний контроль для нормирования данных ОТ-ПЦР в исследовании экспрессии генов развивающегося мозга крысы. Биохимия. 2014; 79(7):888—900.

6. Галеева А. Г., Хаммадов Н. И., Ахунова А. Р. Мультиплексная ПЦР для технологического контроля рекомбинантного штамма E. coli — продуцента антигена вируса КЧС. Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. 2025; 2(70):133—139. DOI: 10.18286/1816-4501-2025-2-133-139.

7. Хаммадов Н. И., Горбунова М. Е., Сальманова Г. Р., Фахрутдинов Н. А., Гулюкин А. М., Галеева А. Г., Громова Е.А. Конструирование специфических праймеров для ПЦР-диагностики классической чумы. Ветеринарный врач. 2024; 3:41—46. DOI: 10.33632/1998-698X_2024_3_41.

8. Хаммадов Н. И. Генетические маркеры вируса ящура крупного рогатого скота, геномный анализ Проблемы особо опасных инфекций. 2019; 2:111—116. DOI: 10.21055/0370-1069-2019-2-111-116.