Экспрессия в E. Coli маркированного рекомбинантного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней

В настоящее время в Российской Федерации для специфической профилактики классической чумы свиней (КЧС) применяются живые аттенуированные вакцины, однако данная стратегия противоречит правилам импорта животной продукции и несет риски рекомбинации с полевыми штаммами. Эти факторы обостряют необходимость дальнейшей разработки кандидатных рекомбинантных вакцин с аналогичной эффективностью и безопасностью. Целью представленной работы явилось конструирование прокариотической системы экспрессии маркированного гликопротеина Е2 вируса КЧС и оценка его иммунохимических свойств. В результате проведенных исследований при помощи биоинформатического анализа был идентифицирован участок первичной аминокислотной последовательности гликопротеина Е2 высокопатогенного штамма вируса КЧС «Ши-Мынь» (субгенотип 1.1) и выполнен дизайн гибридного полипептида, включающего неспецифическую (маркерную) часть из модифицированного эпитопа V5 и фрагмента последовательности BSA. Путем клонирования кодонно-оптимизированного фрагмента в вектор pET-28a был сконструирован штамм-продуцент E. coli BL21(DE3) pLysS/pET-28a/E2-V5. В ходе оптимизации условий культивирования штамма-продуцента было установлено, что наибольший выход целевого белка достигается в течение 5-6 ч после индукции экспрессии. Были определены иммунохимические свойства хроматографически очищенного рекомбинантного rE2-V5: так, было показано, что его активность в непрямом иммуноферментном анализе превышает таковую нативного Е2. Полученные данные свидетельствуют об эффективности разработанной прокариотической системы экспрессии, заключающейся в правильном фолдинге, хорошей растворимости и способности целевого белка образовывать специфические иммунокомплексы. Наличие маркерного фрагмента в экспрессируемом гибридном полипептиде в перспективе позволит использовать последний в качестве основы рекомбинантной вакцины, отвечающей требованиям стратегии DIVA.

1. Алексеев К.П., Раев С.А., Южаков А.В., Шемельков Е.В., Латышев О.Е., Елисеева О.В., Костина Л.В., Цибезов В.В., Стаффорд В.В., Кунаков В.Ю., Верховский О.А., Забережный А.Д., Алипер Т.И. Разработка и испытание образцов рекомбинантной субъединичной вакцины против классической чумы свиней. Сельскохозяйственная биология. 2019; 54(6): 1236-1246. DOI: 10.15389/agrobiology.2019.6.1236rus.

2. Сергеев В.А., Орлянкин Б.Г., Алексеев К.П., Забережный А.Д., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А. Вакцины и стратегия вакцинации против классической чумы свиней. Ветеринария. 2018; 4: 3-11.

3. Оганесян А.С., Шевцов А.А., Щербаков А.В., Коренной Ф.И., Караулов А.К. Классическая чума свиней: ретроспективный анализ эпизоотической ситуации в Российской Федерации (2007-2021 гг.) и прогноз на 2022 г. Ветеринария сегодня. 2022; 11(3): 229-238. DOI: 10.29326/2304-196X-2022-11-3-229-238.

4. Шемельков Е.В., Булгаков А.Д., Куликова Т.С., Верховский О.А., Кунаков В.Ю., Котельников А.П., Алипер Т.И. Изучение продолжительности поствакцинального иммунного ответа при использовании субъединичной маркированной вакцины против классической чумы свиней. Аграрная наука. 2022; 3: 23-27. DOI: 10.32634/0869-8155-2022-357-3-23-27.

5. Алипер Т.И., Алексеев К.П., Шемельков Е.В., Верховский О.А., Забережный А.Д. Перспектива использования маркированных вакцин против классической чумы свиней в Российской Федерации. Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов: материалы МПК, посвященной 100-летию Армавирской биофабрики. 2021. 54-60. DOI: 10.47804/978-5-89904-028-3_2021_ 54.

6. Wang F., Yu Q., Hu M., Xing G., Zhao D., Zhang G. Purification of Classical Swine Fever Virus E2 Subunit Vaccines Based on High Affinity Peptide Ligand. Protein Pept Lett. 2021; 28(5):554-562. DOI: 10.2174/0929866527666201103152100.

7. Kumar R., Kumar V., Kekungu P., Barman N.N., Kumar S. Evaluation of surface glycoproteins of classical swine fever virus as immunogens and reagents for serological diagnosis of infections in pigs: a recombinant Newcastle disease virus approach. Arch Virol. 2019; 164: 3007-3017. DOI: 10.1007/s00705-019-04425-4.

8. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidaselabeled antibody: a new method of conjugation. J. Histochem. Cytochem. 1974; 22(12). DOI: 10.1177/22.12.1084.

9. Патент RU2250263C1. Андреев В.Г., Безбородова С.В. Рекомбинантная плазмидная ДНК p30NE2, кодирующая 181-аминокислотный N-концевой фрагмент гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней и обеспечивающая его экспрессию в клетках E. coli. Заявитель и патентообладатель – ФГУ «ВНИИЗЖ». Дата публикации – 27.01.2005.

10. Патент RU2406534C2. Толедо Алонсо Х.Р., Санчес Рамос О., Баррера Валле М.И., Фигероа Байле Н.Э., Прието Карратала Я., Родригес Мольто М.П., Фриас Лепуро М.Т., Боррото Нордело К.Г. Химерные вакцинные антигены против вируса классической чумы свиней. Заявитель и патентообладатель – Сентро де Инхеньерия Хенетика и Биотекнолохия (CU). Дата публикации – 07.09.2007.

11. Patent EP2382307B1. Kortekaas J.A., Vloet R.P.M. Recombinant classical swine fever virus (CSFV) comprising a modified E2 protein and methods for generating said recombinant CSFV. Current Assignee: Intervet International BV. Publication date: 02.11.2011.

12. Wei Q., Liu Yu., Zhang G. Research Progress and Challenges in Vaccine Development against Classical Swine Fever Virus. Viruses. 2021; 13(3): 445. DOI: 10.3390/v13030445.

13. Kimple M. E., Brill A. L., Pasker R. L. Overview of affinity tags for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. 2013; 73(9).