Анализ полиморфизма гена LIPL32 патогенных лептоспир для разработки тест-системы с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Целью данной работы являлось изучение полиморфизма гена LipL32 различных сероваров патогенных лептоспир, а также разработка прототипа тестсистемы для индикации данного гена с использованием метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с оценкой его стабильности. Объектами исследования служили 245 нуклеотидных последовательностей гена LipL32 Leptospira interrogans, образцы ДНК лептоспир сероваров Pomona, Grippotyphosa, Canicola, Bataviae и Tarassovi. По результатам биоинформационного анализа 245 нуклеотидных последовательностей гена LipL32 установили, что данный ген является высококонсервативным участком генома возбудителя лептоспироза. Для индикации исследуемого патогена по данному гену методом ПЦР-РВ, определили маркерный локус (область липопротеина L32) размером 173 пар нуклеотидов. В пределах данного участка разработали олигонуклеотидные праймеры и зонд, которые по данным множественного выравнивания амплифицируемого локуса оказались идентичными для большинства анализируемых нуклеотидных последовательностей гена LipL32 L. interrogans. BLAST-анализ отсеквенированных нуклеотидных последовательностей патогенных леп тоспир сероваров Pomona, Grippotyphosa, Canicola, Bataviae и Tarassovi показал, что идентичность амплифицированного сконструированными олигонуклеотидами участка гена липопротеина L32 указанных выше изолятов с последовательностями ДНК возбудителя лептоспироза, сохраненных в базе данных NCBI, варьировала от 95,74 до 98,95 %. С использованием разработанных олигонуклеоидов и флуоресцентного зонда сконструирован прототип тест-системы для индикации патогенных лептоспир методом ПЦРРВ. Установлено, что специфичность представленного в настоящей работе тест- набора составила 100 %, а чувствительность может достигать 5·10² копий ДНК в одном мл исследуемого материала. Результат оценки стабильности опытного образца тест-системы показал, что коэффициенты вариации минимальных пороговых значений не превышают 10 %, таким образом компоненты набора устойчивы к длительному хранению.

1. Ананьина, Ю. В. Паразитические и свободноживущие лептоспиры (Leptospiraceae): эколого-генетические особенности. Зоологический журнал. 2010; Т. 89 (1): 48-52.

2. Ulsenheimer B.C., Tonin A.A, von Laer A.E., Fernandes Dos Santos H., Antônio Sangioni L., Fighera R., Yuri Dos Santos M., Isabel Brayer Pereira D., Pötter L., De Avila Botton S. Molecular detection and phylogenetic analysis of Leptospira interrogans and Leptospira borgpetersenii in cats from Central region of Rio Grande do Sul state, Brazil. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2025; 116. 102286. https://doi:10.1016/j.cimid.2024.102286.

3. Орынтаев, К.Б. Ермагамбетова С. Е., Меңтай А. Специфическая профилактика лептоспироза крупного рогатог скота. Вестник Кыргызского национального аграрного университета им. К.И. Скрябина. 2017; 4(45): 260-261.

4. Шангараев Р.И., Усольцев К.В., Хаертынов К.С., Горбунова М.Е., Хаммадов Н.И., Сафина Р.Ф., Осянин К.А. Обзор эпизоотической ситуации по лептоспирозу в Российской Федерации за период 2013-2023 гг. Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2024; 10(240): 65-72. https://doi:10.53083/1996-4277-2024-240-10-65-72.

5. Самсонова, А.П., Петров Е.М. Сравнение показателей эффективности методов диагностики лептоспирозов в разные сроки с момента заболевания. Бактериология. 2023; 8(3): 99.

6. Нурлыгаянова, Г. А., Белоусов В. И., Шарыпов А. С. Результаты лабораторной диагностики лептоспироза животных различными методами в Российской Федерации за 2021 г. Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2023. 9: 75-86. https://doi:10.36871/vet.zoo.bio.202309009.

7. Хаммадов Н.И., Горбунова М.Е., Сальманова Г.Р., Фахрутдинов Н.А., Гулюкин А.М., Галеева А.Г., Громова Е.А. Конструирование специфических праймеров для ПЦР- диагностики классической чумы свиней. Ветеринарный врач. 2024; 3: 41-46. https://doi:10.33632/1998-698X_2024_3_41.

8. Громова Е.А., Миргазов Д.А., Додонова Е.А., Елизарова И.А., Горбунова М.Е., Осянин К.А. Разработка мультиплексной ПЦР-РВ тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза. Ветеринарный врач. 2024; 3: 34-40. https://doi:10.33632/1998-698X_2024_3_34.

9. Khaki P., Rahimi-Zarchi F., Moradi Bidhendi S., Gharakhani M. Application of a Multiplex PCR Assay for Molecular Identification of Pathogenic and Non-Pathogenic Leptospires based on LipL32 and 16S rRNA Genes. Arch. Razi. Inst. 2023; 78(1): 413- 418. https://doi:10.22092/ARI.2022.359211.2388.

10. Podgoršek D., Ružić-Sabljić E., Logar M., Pavlović A., Remec T., Baklan Z., Pal E., Cerar T. Evaluation of real-time PCR targeting the LipL32 gene for diagnosis of Leptospira infection. BMC Microbiol. 2020; 20(1). https://doi: 10.1186/s12866-020-01744-4.

11. Latifah I., Abdul Halim A., Rahmat M.S., Nadia M.F., Ubil Z.E., Asmah H., Shafariatul Akmar I., Picardeau M., Siti Haslina O., Nasir M.A. Isolation by culture and PCR identification of LipL32 gene of pathogenic Leptospira spp. in wild rats of Kuala Lumpur. Malaysian J. Pathol. 2017; 39 (2): 161-166.

12. Vedhagiri K., Natarajaseenivasan K., Chellapandi P., Prabhakaran S.G., Selvin J., Sharma S., Vijayachari P. Evolutionary implication of outer membrane lipoproteinencoding genes ompL1, UpL32 and lipL41 of pathogenic leptospira species. Genomics Proteomics Bioinf. 2009; 7: 96-106. https://doi: 10.1016/S1672-0229(08)60038-8.

13. Picardeau M., Bulach D.M, Bouchier C., Zuerner R.L., Zidane N., Wilson P.J., Creno S., Kuczek E.S., Bommezzadri S., Davis J.C., McGrath A., Johnson M.J., BoursauxEude C., Seemann T., Rouy Z., Coppel R.L., Rood J.I., Lajus A., Davies J.K., Médigue C., Adler B. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis PLoS. ONE. 2008; 3. https://doi: 10.1371/journal.pone.0001607.

14. Nally J.E., Whitelegge J.P., Bassilian S., Blanco D. R., Lovett M. A. Characterization of the outer membrane proteome of Leptospira interrogans expressed during acute lethal infection Infect. Immun. 2007; 75766- 75773. https://doi: 10.1128/IAI.00741-06.

15. Kumaran S.K., Faizal Abu Bakar M., Mohd-Radil H., Mat-Sharani S., Sakinah S., Poorani K., Alsaeedy H., Peli A., Seoh Wei T., Pooi Ling M., Awang Hamat R., Kumari Neela V., Higuchi A., Alarfaj A.A., Rajan M., Benelli G., Arulselvan P., Suresh Kumar S. 3D modelling of the pathogenic Leptospira protein LipL32: A bioinformatics approach. Acta Tropica. 2013; 76: 433-439. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2017.09.011.

16. Ваганова А.Н., Фрейлихман О.А., Стоянова Н.А., Токаревич Н.К. Межвидовой полиморфизм рестрикционных профилей гена lipL32 патогенных лептоспир. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010; 149(5): 543-545.