Методические аспекты выделения внеклеточной ДНК из антральных овариальных фолликулов Sus scrofa domesticus

Оценка качества донорских ооцитов животных и их компетентности к оплодотворению является важной задачей в репродуктивной биотехнологии. Одним из перспективных неинвазивных биомаркеров, который может использоваться для вышеобозначенных целей, является внеклеточная ДНК (внДНК). Этот показатель активно исследуется в медицине, ориентированной на человека, однако его значение в оценке женских гамет продуктивных животных остается недостаточно изученным. В настоящем исследовании проведен анализ содержания внДНК в фолликулярной жидкости свиней, аспирированной из антральных овариальных фолликулов (диаметр ˃3мм, 3-5мм, < 5мм), проанализировано влияние различных режимов центрифугирования на её выделение, а также оценена жизнеспособность клеток гранулезы (доля клеток с пикнотическими ядрами). Уровень клеток в состоянии пикноза определяли методом Тарковского, включающим гипотоническую обработку цитратом натрия, фиксацию уксусно-метанольной смесью и микроскопический анализ после окрашивания по Романовскому–Гимзе. Установлено, что концентрация внДНК в жидкости фолликулов изменяется в зависимости от их диаметра и режима центрифугирования. При увеличении ускорения центрифугирования наблюдалось снижение количества внДНК и рост доли клеток с пикнотическими ядрами, что свидетельствует об их повреждении. Идентифицирован режим центрифугирования (603,72 g в течение 5 минут), обеспечивающий максимальный уровень содержания внДНК при минимальном количестве пикнотических клеток. Кроме того, полученные данные согласуются с гипотезой о том, что внДНК может служить индикатором клеточного стресса, что особенно важно при оценке качества биоматериала в условиях in vitro. Представленные результаты подчеркивают важность выбора параметров центрифугирования для эффективного выделения внДНК с целью ее дальнейшего изучения как потенциального биомаркера качества ооцитов и перспективного прогностического индикатора фертильности продуктивных животных.

1. Сафронова Н.А., Калинина Е.А., Донников А.Е., Бурменская О.В., Макарова Н.П., Кулакова Е.В., Алиева К.У. Перспективы исследования маркеров клеток кумулюса для оценки качества ооцитов и эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий // Акушерство и гинекология. – 2015. – № 12.

2. Станиславович Т. И., Кузьмина Т. И., Молчанов А. В. Оценка деструктивных процессов хроматина гранулезных клеток овариальных фолликулов коров и функциональный статус ооцита // Аграрный вестник Урала. 2019. № 12 (191) С. 60‒64. DOI: 10.32417/1997-4868-2019-191-12-60-64.

3. Гапоненко А.А., Митюрина Е.В., Франкевич В.Е. Метаболомный профиль фолликулярной жидкости как маркер качества ооцитов // Акушерство и гинекология. – 2021. – № 11. – С. 26–31. DOI:10.18565/aig.2021.11.26-31.

4. Scalici E, Mulet T, Ferrier Hoa A, et al. Circulating nuclear acids and infertility. Gynecol Obstet Fertil. 2015; DOI: 10.1016/j.gyobfe.2015.07.016.

5. Андреева Е. А., Хонина Н. А., Демченко Е. Н., Гаврилова Е. Д., Пасман Н. М., Козлов В. А., Черных Е. Р. Свободная ДНК в фолликулярной жидкости у женщин с различными показателями овариальной функции. Бюллетень сибирской медицины. 2019; 18 (2): 16–23. DOI: 10.20538/1682-0363-2019-2-16-23

6. De Borre M, Che H, Yu Q, et al. Cell-free DNA methylome analysis for early preeclampsia prediction. Nat Med. 2023;29 (9):2206-15. DOI:10.1038/s41591-023-02510-5.

7. Adil, M., Kolarova, T.R., Doebley, AL. et al. Preeclampsia risk prediction from prenatal cell-free DNA screening. Nat Med (2025). DOI:10.1038/s41591-025-03509-w

8. Stroun M, Lyautey J, Olson-Sand A, Anker P. 2001. About the possible origin and mechanism of circulating DNA. Apoptosis and active DNA release. Clin Chim Acta. 313(1–2):139–142. DOI:10.1016/s0009-8981(01)00665-9.15

9. Aucamp J, Bronkhorst AJ, Badenhorst CPS, Pretorius PJ. 2018. The diverse origins of circulating cell-free DNA in the human body: a critical re-evaluation of the literature. Biol Rev Camb Philos Soc. 93(3):1649, 168. DOI: 10.1111/BRV.12413.

10. Fernández-Domínguez, I. J., ManzoMerino, J., Taja-Chayeb, L., DueñasGonzález, A., Pérez-Cárdenas, E., amp; Trejo-Becerril, C. The role of extracellular DNA (exDNA) in cellular processes. Cancer Biology & Therapy, 22(4), 267–278. Fernández-Domínguez, I. J., Manzo-Merino, J., Taja-Chayeb, L., Dueñas-González, A., Pérez-Cárdenas, E., amp; Trejo- Becerril, C. (2021). The role of extracellular DNA (exDNA) in cellular processes. Cancer Biology amp; Therapy, 22(4), 267–278. DOI:10.1080/15384047.2021.1890319

11. Keeling PJ, Palmer JD. 2008. Horizontal gene transfer in eukaryotic evolution. Nat Rev Genet. 9(8):605–618. DOI: 10.1038/nrg2386.

12. Kustanovich A, Schwartz R, Peretz T, Grinshpun A. Life and death of circulating cell-free DNA. Cancer Biol Ther. 2019;20 (8):1057–1067. DOI:10.1080/15384047.2019.1598759.

13. Костюк С.В. Роль внеклеточной ДНК в функциональной активности генома человека // Вестник РАН. – 2010. – Т. 80, № 9. – С. 746–752.

14. McCarthy C. G., Wenceslau C. F., Goulopoulou S., Ogbi S., Baban B., Sullivan J. C., et al. (2015). Circulating mitochondrial DNA and Toll-like receptor 9 are associated with vascular dysfunction in spontaneously hypertensive rats. Cardiovasc. Res. 107 119– 130. DOI: 10.1093/cvr/cvv137

15. Rykova E, Morozkin E, Ponomaryova A, Loseva E, Zaporozhchenko I, Cherdyntseva N, Vlassov V, Laktionov P. 2012. Cell-free and cell-bound circulating nucleic acid complexes: mechanisms of generation, concentration and content. Expert Opin Biol Ther. 12(Suppl sup1):S141–S153. DOI:10.1517/14712598.2012.673577.

16. Thierry AR, El Messaoudi S, Gahan PB, Anker P, Stroun M. 2016. Origins, structures, and functions of circulating DNA in oncology. Cancer Metastasis Rev. 35(3):347 –376. DOI:10.1007/s10555-016-9629-x.

17. Wang W, Kong P, Ma G, Li L, Zhu J, Xia T, Xie H, Zhou W, Wang S. 2017. Characterization of the release and biological significance of cell-free DNA from breast cancer cell lines. Oncotarget. 8(26):43180– 43191. DOI: 10.18632/oncotarget.17858.

18. Sato Y, Matoba R, Kato K. 2019. Recent advances in liquid biopsy in precision oncology research. Biol Pharm Bull. 42(3):337– 342. DOI: 10.1248/bpb.b18-00804.13

19. McCarthy C. G., Wenceslau C. F., Goulopoulou S., Ogbi S., Baban B., Sullivan J. C., et al. (2015). Circulating mitochondrial DNA and Toll-like receptor 9 are associated with vascular dysfunction in spontaneously hypertensive rats. Cardiovasc. Res. 107 119– 130. DOI:10.1093/cvr/cvv137

20. Lowes H., Pyle A., Santibanez-Koref M., Hudson G. (2020). Circulating cell-free mitochondrial DNA levels in Parkinson’s disease are influenced by treatment. Mol. Neurodegener. 15:10. DOI: 10.1186/s13024-020-00362-y

21. Vakrakou A. G., Boiu S., Ziakas P. D., Xingi E., Boleti H., Manoussakis M. N. (2018). Systemic activation of NLRP3 inflammasome in patients with severe primary Sjögren’s syndrome fueled by inflammagenic DNA accumulations. J. Autoimmun. 91 23 –33. DOI: 10.1016/j.jaut.2018.02.010

22. Scalici E., Mulet T., Ferrier Hoa A., Gala A., Lu V., Anahori T. et al. Circulating nuclear acids and infertility. Gynecol Obstetric Fertil. 2015; 43:593-8. DOI: 10.1016/j.gyobfe.2015.07.016.

23. Traver S, Scalici E, Mullet T, Molinari N, Vincens C, Anahory T, Hamamah S. Cellfree DNA in Human Follicular Microenvironment: New Prognostic Biomarker to Predict in vitro Fertilization Outcomes PLoS ONE. 2015;10(8):e0136172. DOI: 10.1371/journal.pone.0136172.

24. Guan Y., Zhang W., Wang X., Cai P., Jia Q., Zhao W. Cell-free DNA induced apoptosis of granulosa cells by oxidative stress. Clin. Chim. Acta. 2017; 473: 213– 217. DOI: 10.1016/j.cca.2016.11.023.

25. Ichikawa K., Shibahara H., Shirasuna K., Kuwayama T., Iwata H. Cell-free DNA content in follicular fluid: a marker for the developmental ability of porcine oocytes. Reproductive Medicine and Biology. 2019. Vol. 19. P. 95-103. DOI: 10.1002/rmb2.12309.

26. Tarkowski AK. An air-drying method for chromosome preparation from mouse eggs. Cytogenetics. 1966;5(3):394-400. DOI:10.1159/000129914

27. Woodruff TK, Shea LD. The role of the extracellular matrix in ovarian follicle development. Reprod Sci. 2007 Dec;14(8 Suppl):6 -10. DOI: 10.1177/1933719107309818.

28. Liu Z, Li F, Xue J, Wang M, Lai S, Bao H, He S. Esculentoside A rescues granulosa cell apoptosis and folliculogenesis in mice with premature ovarian failure. Aging (Albany NY). 2020 Aug 5;12(17):16951- 16962. DOI: 10.18632/aging.103609. Epub 2020 Aug 5.

29. Xie J, Xu X, Liu S. Intercellular communication in the cumulus-oocyte complex during folliculogenesis: A review. Front Cell Dev Biol. 2023 Jan 19; 11:1087612. DOI: 10.3389/fcell.2023.1087612.

30. Avalos PN, Wong LL, Forsthoefel DJ. Extracellular vesicles promote proliferation in an animal model of regeneration. bioRxiv [Preprint]. 2024 Mar 27:2024.03.22.586206. DOI: 10.1101/2024.03.22.586206.

31. Chaves MA, Ferst JG, Fiorenza MF, Vit FF, da Silveira JC. The Influence of Ovarian -Derived Extracellular Vesicles in Reproduction. Adv Anat Embryol Cell Biol. 2025 Jan 1. DOI: 10.1007/102_2024_9.