Биореакторная оптимизация коэкспрессии гетерологичных белков в рекомбинантном штамме Lactobacillus spp.

Разработка высокопродуктивных пробиотических штаммов, способных к синтезу терапевтических белков, требует комплексного подхода, сочетающего генетическое конструирование с оптимизацией условий ферментации. В данном исследовании разработан и валидирован усовершенствованный протокол трехэтапного культивирования рекомбинантного штамма Lactobacillus spp., обеспечивающего коэкспрессию интерлейкинов IL-10 и IL-22, в биореакторе с автоматическим контролем критических параметров — pH, температура, растворенный кислород. В работе использовали рекомбинантные штаммы, трансформированные плазмидой pLacDualIL10/IL22. Культивирование проводили в стеклянном биореакторе (рабочий объем 600 мл) с автоматическим контролем pH, температуры и растворенного кислорода. Реализован трехэтапный режим: фаза роста (37°C, pH 6,8), фаза индукции (1 мМ IPTG, 30°C) и фаза продукции. Очистку белков проводили тангенциальной ультрафильтрацией и аффинной хроматографией на Ni-NTA агарозе. Количественный анализ IL-10 и IL-22 выполняли методом ELISA, чистоту оценивали с помощью SDS-PAGE, биологическую активность – в пролиферативном тесте на лимфоцитах PBMC. Применение стратегии, включающей фазы роста, индукции (1 мМ IPTG, 30°C) и продукции, позволило достичь значительного увеличения выхода целевых белков: до 120±15 мг/л для IL-10 и 95±10 мг/л для IL-22, что в 2—3 раза превышает показатели при культивировании в колбах. Последующая очистка методом тангенциальной ультрафильтрации и аффинной хроматографии обеспечила получение белков высокой степени чистоты >95 % и >93 %, соответственно с сохраненной биологической активностью 1,2×10⁶ ЕД/мг для IL-10 и 8,5×10⁵ ЕД/мг для IL-22. Предложенная методика демонстрирует высокую воспроизводимость и эффективность, что подтверждает ее перспективность для масштабируемого производства функциональных рекомбинантных цитокинов на пробиотической платформе.

1. He, Y. Probiotic potential of lactic acid bacteria isolated from yaks / Y. He, F. Li, M. Xu, Z. Wang, H. Li // Animal Diseases. — 2024. — Vol. 4, No. 1. — Art. 17. DOI: 10.1186/s44149-024-00124-z.

2. Wei, H. X. IL 10 and IL 22 in mucosal immunity: driving protection and pathology / H. X. Wei, B. Wang, B. Li // Frontiers in Immunology. — 2020. — Vol. 11. — Art. 1315. DOI: 10.3389/fimmu.2020.01315.

3. Zhang, J. Characterization of Lactobacillus spp. Isolated from layer hens as probiotic candidates / J. Zhang, A. R. McWhorter, S. Khan, Y. Sun, J. Wang // BMC Veterinary Research. — 2025. — Vol. 21, No. 1. — Art. 416. DOI: 10.1186/s12917-025-04847-0.

4. Vandermies, M. Bioreactor scale strategies for the production of recombinant protein in the yeast Yarrowia lipolytica / M. Vandermies, P. Fickers // Microorganisms. — 2019. — Vol. 7, No. 2. — Art. 40. DOI: 10.3390/microorganisms7020040.

5. Wu, J. Genetic tools for the development of recombinant lactic acid bacteria / J. Wu, Y. Xin, J. Kong, T. Guo // Microbial Cell Factories. — 2021. — Vol. 20, No. 1. — Art. 118. DOI: 10.1186/s12934-021-01607-1.

6. Yang, Y. Metabolic engineering of Lactobacilli spp. For disease treatment / Y. Yang, P. Yu, Y. Huang, W. Zhang, Y. Nie, C. Gao // Microbial Cell Factories. — 2025. — Vol. 24, No. 1. — Art. 53. DOI: 10.1186/s12934-025-02682-4.

7. Rudolph, S. E. Set up and utilization of a three dimensional in vitro bioreactor system for human intestinal studies and microbial co cultures / S. E. Rudolph, E. Bethi, L. Iglesias Ledon, H. U. Kumarasinghe, O. Da’darah, G. K. Salgam, K. C. Vieira, Y. Chen, D. L. Kaplan // Current Protocols. — 2024. — Vol. 4, No. 9. — Art. e70013. DOI: 10.1002/cpz1.70013.

8. Tian, X. Application of 8 parallel micro bioreactor system with non invasive optical pH and DO biosensor in high throughput screening of L lactic acid producing strain / X. Tian, G. Zhou, W. Wang, J. Zhang, Y. Cai // Bioresources and Bioprocessing. — 2018. — Vol. 5, No. 1. — Art. 20. DOI: 10.1186/s40643-018-0207-7.