Разработка способа одновременной идентификации возбудителей лей-коза и иммунодефицита крупного рогатого скота

Статья описывает процесс разработки способа одновременной генетической идентификации нуклеиновых кислот вирусов лейкоза (ВЛ) и иммунодефицита (ВИ) крупного рогатого скота (КРС). При создании данного способа были использованы ранее разработанные праймерные комбинации к провирусным ДНК ВЛ КРС, ВИ КРС и ДНК КРС. Для контроля амплификации были созданы два положительных контрольных образца (ПКО), представляющие собой рекомбинантные генетические конструкции на основе плазмиды pALT2 со встроенными специфичными нуклеотидными последовательностями участков провирусной ДНК ВЛ КРС и ВИ КРС. Подобран оптимальный температурно-временной режим и экспериментально доказана его работоспособность. Методом десятикратных разведений рекомбинантных плазмид, несущих специфичные гены ВЛ КРС и ВИ КРС, определена минимальная чувствительность, которая составила 1 – 3 молекул ДНК в 1 мкл реакционной смеси для генов обоих возбудителей. Также в результате проведения ПЦР с образцами гетерогенной и гомогенной ДНК доказана высокая специфичность разработанного способа. Практическая значимость и работоспособность разработанного способа подтверждены исследованиями образцов крови КРС, полученных от больных и здоровых животных, из животноводческих хозяйств неблагополучных по лейкозу. Предложенный способ позволяет одной реакцией и в одной реакционной смеси обнаруживать и идентифицировать провирусную ДНК ВЛ КРС и ВИ КРС одновременно.

1. Агольцов В.А. Сравнительная диагностическая оценка серологического и молекулярно-генетического методов лабораторных исследований на лейкоз крупного рогатого скота / В.А. Агольцов, Е.С. Красникова, А.А. Щербаков, П.С. Мелкина, Е.А. Горельникова, Н.А. Дружаева // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2012. - № 4 (90). - C. 56-59.

2. Апалькин В.А., Гулюкин М.И., Петров Н.И. Лейкоз крупного рогатого скота. - СПб.: Петролазер, 2005. - 105 с.

3. Байсеитов С.Т., Новикова Н.Н., Власенко В.С., Красиков А.П. Сравнительная оценка диагностической эффективности РИД, ИФА и РНИФ при лейкозе крупного рогатого скота. Вестник Омского государственного аграрного университета. 2020. № 1 (37). С. 97-102.

4. Козырева Н.Г., Иванова Л.А., Степанова Т.В., Гулюкин М.И. Лабораторные испытания разработанной мультиплексной ПЦР-РВ при диагностике лейкоза крупного рогатого скота у молодняка. Российский журнал «Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии» № 1(29), 2019.

5. Красникова Е.С. Анализ аминокислотного состава молока коров, инфицированных ретровирусами / Е.С. Красникова, А.В. Банникова, А.В. Евтеев, Г.Х. Утанова. // В сборнике: Актуальные проблемы ветеринарной хирургии, онкологии и терапии. - 2016. - С. 87-92.

6. Красникова Е.С. Оценка качества молока, полученного от инфицированных ретровирусами коров, и определение способов его переработки / Е.С. Красникова, Г.Х. Утанова, Н.А. Федосов, А.А. Щербаков // Научное обозрение. 2015. - № 17. - С. 10-15.

7. Красникова, Е.С. Эпизоотическая ситуация по ретровирусным инфекциям животных в Саратовской области и оптимизация лабораторной диагностики / Е.С. Красникова, В.А. Агольцов, О.Е. Семенова // Современные технологии в ветеринарии зоотехнии. Творческое наследие В.К. Бирха: мат. Междунар. науч.-практич. конф. – Пермь. 2013. – С. 100-106.

8. Криворучко, С.В. Вирус иммунодефицита крупного рогатого скота в хозяйствах Ставропольского края / С.В. Криворучко, С.С. Абакин, Г.А. Дубравная // Ветеринарная патология. - 2012. - № 2 (40). - С. 35-38.

9. Никитин А.И., Усольцев К.В., Фаизов Т.Х., Чернов А.Н., Усольцева И.И., Семенова М.Е., Хаммадов Н.И., Алеева З.З., Хусниев Ф.А., Ахмадеев Р.М., Валидов Ш.З., Шуралев Э.А. Способ экспрессдиагностики лейкоза крупного рогатого скота. Патент на изобретение RU 2644233 C2, 08.02.2018. Заявка № 2016109396 от 15.03.2016.

10. Сафина Р.Ф. Повышение чувствительности и специфичности ПЦР с использованием ДНК-маркеров, кодирующих белки p24 и gp51, в ПЦР-РВ для индикации ВЛКРС / Сафина Р.Ф., Лукманова Г.Р., Усольцев К.В., Хаммадов Н.И., Фаизов Т.Х. // Ветеринарный врач. - 2019. - № 2. - С. 8-14.

11. Сюрин В.Н., Самуйленко А Я., Соловьёв Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. – М.: ВНИТИБП, 2001. - 446 c.

12. Усольцев К.В. Способ одновременной экспресс диагностики лейкоза и вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота на основе метода мультиплексной ПЦР / К.В. Усольцев, Н.И. Хаммадов, К.А. Осянин, Т.Х. Фаизов // В книге: Физико-химическая биология как основа современной медицины тезисы докладов участников Республиканской конференции с международным участием, посвященной 110-летию со дня рождения В. А. Бандарина. Белорусский государственный медицинский университет. - 2019. - С. 122-123.

13. Утанова, Г.Х. Молекулярногенетическая диагностика вируса бычьего иммунодефицита / Г.Х Утанова, А.П. Силаев // Сборник трудов IХ Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА 2017» / Под редакцией академика РАН В.И. Покровского. - ТОМ II. – МОСКВА, 2017. - С. 407 – 408.

14. Хаммадов Н.И. Генетические маркеры вируса ящура крупного рогатого скота, геномный анализ // Проблемы особо опасных инфекций. - 2019. - № 2. - С. 111-116.

15. Bazargani T.T. The first survey on the status of the bovine immunudeficiency virus infection and associated clinical, pathological, haematological and flow cytometric findings in holestein cattle in Iran / T.T. Bazargani, M. Tooloei, G.N. Broujeni, M.J. Garagozlo, S. Bokaei, M. Khormali, N. Barjaste // Journal of Veterinary Research. – 2010. - №65. – P.1–12.

16. Carpenter S. Characterization of early pathogenic effects after experimental infection of calves with bovine immunodeficiency-like virus. / Carpenter S., Miller L.D., Alexandersen S., Whetstone C.A., Van Der Maaten M.J., Viuff B., Wannemuehler Y., Miller J.M., Roth J.A. // J. Virol. 1992; 66:1074–83.

17. Egberink H. Animal immunodeficiency viruses / H. Egberink, M.C Horzinek. // Veterinary Microbiology. – 1992. - №33. – P.311-331.

18. González-Fernández V.D. First evidence of bovine immunodeficiency virus infection in Mexican cattle / V.D. GonzálezFernández, J.L. Tórtora Pérez, M.M. García Flores, J.Á. Aguilar Setién, H. Ramírez Álvarez // Transboundary and Emerging Diseases. - 2020.

19. Pablo-Maiso L. Prospects in innate immune responses as potential control strategies against non-primate lentiviruses / L. Pablo-Maiso, A. Doménech, I. Echeverría, C. Gómez-Arrebola, D. de Andrés, S. Rosati, E. Gómez-Lucia, R. Reina // Viruses. – 2018. - №10 (8). – P. 435.

20. Snider T.G. Natural and experimental bovine immunodeficiency virus infection in cattle. / Snider T.G., Hoyt P.G., Jenny B.F., Coats K.S., Luther D.G., Storts R.W., Battles J.K., Gonda M.A. // Vet Clin North Am Food Anim Pract. 1997 Mar; 13(1):151-76. Review.

21. Отчёт по эпизоотической ситуации в Российской Федерации за 2019 г. Официальный сайт Россельхознадзора (https://fsvps.gov.ru/fsvps-docs/ru/iac/rf/2019/iac2019.pdf

22. Ветеринарные правила осуществления профилактических, диагностических, ограничительных и иных мероприятий, установления и отмены карантина и иных ограничений, направленных на предотвращение распространения и ликвидацию очагов лейкоза крупного рогатого скота (Зарегистрировано в Министерстве юстиции Российской Федерации 29 апреля 2021 года, регистрационный N 63300). https://docs.cntd.ru/document/603433105?marker=6540IN

23. Расчётные онлайн-формы для конверсии массы в моли. Интернет ресурс MolBiol.ru. http://molbiol.ru/scripts/01_07.html

24. Таксономическая классификация NCBI: txid11646. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id=11646&lvl=3&lin=f&keep=1&srchmode=1&unlock

25. Международный комитет по таксономии вирусов (ICTV). https://talk.ictvonline.org/taxonomy/

26. Онлайн-утилита BLAST интернетресурса NCBI https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome

27. ФГБНУ «Федеральный центр радиационной, токсикологической и биологической безопасности» Научный Городок2, Казань, Республика Татарстан, 422701.