Дизайн дуплексной пцр в реальном времени для выявления мяса убоя курицы в смешанной мясной продукции

Лабораторные ПЦР методики, которые используют при контроле качества мясных пищевых продуктов, как правило, выявляют митохондриальные последовательности ДНК (мтДНК). Множественность копий мтДНК в клетке обеспечивает высокую чувствительность таких методик. Высокая чувствительность ПЦР, выявляющих мтДНК курицы (Gallus gallus), может приводить к положительному результату при анализе продукции, содержащей куриные яйца. Однако ряд мясных изделий, в частности, некоторые вареные колбасы, не содержат мясо убоя курицы, при этом при их приготовлении используют куриные яйца или меланж. Методики, в основе которых лежит ПЦР, выявляющая мтДНК, не способны отличить добросовестное следование рецептуре от фальсификации мясного состава таких изделий более дешёвым куриным мясом. В данной работе мы осуществили дизайн ПЦР «в реальном времени», целевыми последовательностями которой являются ядерные последовательности. Отдельной задачей был подбор праймеров для ПЦР, служащей для внутреннего контроля, где целевыми последовательностями являются ядерные последовательности, консервативные для животных и птиц. Мы показали, что использование уникальных хромосомных последовательностей в качестве целевых последовательностей позволяет избавиться от положительных результатов в ПЦР, где в качестве матрицы используется ДНК, выделенная из куриных яиц или меланжа. Методика на основе разработанных ПЦР может быть использована для выявления фальсификации состава смешанных мясных изделий мясом убоя курицы.

1. Фомина Т. А., Минаев М. Ю. Система идентификации для контроля халяльной мясной продукции //Мясная индустрия. – 2011. – №. 3. – С. 32-34.

2. Красюков Ю. Н. и др. Качественная видовая идентификации яиц в яичных продуктах методом полимеразной цепной реакции //Новое в технике и технологии переработки птицы и яиц. – 2011. –С. 51-83.

3. López-Andreo M. et al. Detection and quantification of meat species by qPCR in heat-processed food containing highly fragmented DNA //Food Chemistry. – 2012. – Т. 134. – №. 1. – С. 518-523.

4. Soares S. et al. A SYBR Green real-time PCR assay to detect and quantify pork meat in processed poultry meat products //Meat Science. – 2013. –Т. 94. – №. 1. –С. 115-120.

5. Floren C. et al. Species identification and quantification in meat and meat products using droplet digital PCR (ddPCR) //Food chemistry. – 2015. –Т. 173. –С. 1054-1058.

6. Yamoah F., Yawon D. Assessing supermarket food shopper reaction to horsemeat scandal in the UK //International Review of Management and Marketing. – 2014.

7. Kocher T. D. et al. Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1989. – Т. 86. – №. 16. – С. 6196-6200.

8. D'Erchia A. M. et al. Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity // Mitochondrion. – 2015. – Т. 20. – С. 13-21.

9. ГОСТ 20402-2014 Колбасы вареные фаршированные. Технические условия. — М.: Стандартинформ, 2019. — 18 с

10. ГОСТ 23670-2019 Изделия колбасные вареные мясные. Технические условия. — М.: Стандартинформ, 2019. — 32 с

11. ГОСТ Р 54646-2011 Колбасы ливерные. Технические условия. — М.: Стандартинформ, 2012. — 18 с.

12. Klein S., Grossmann R. Cell number and sex ratio in unfertilized chicken eggs (Gallus gallus domesticus) //Journal of Experimental Zoology Part A: Ecological Genetics and Physiology. – 2008. –Т. 309. – №. 1. –С. 47-54.

13. Iwobi A. et al. A multiplex real-time PCR method for the quantification of beef and pork fractions in minced meat //Food chemistry. – 2015. – Т. 169. – С. 305-313.

14. Iwobi A. et al. A multiplex real-time PCR method for the quantitative determination of equine (horse) fractions in meat products // Food Control. – 2017. – Т. 74. – С. 89-97

15. Druml B. et al. A novel reference realtime PCR assay for the relative quantification of (game) meat species in raw and heatprocessed food //Food Control. – 2016. – Т. 70. – С. 392-400

16. Laube I. et al. Development and design of a ‘ready‐to‐use’reaction plate for a PCR‐ based simultaneous detection of animal species used in foods //International journal of food science & technology. – 2007. – Т. 42. – №. 1. – С. 9-17.

17. Amaral J. S. et al. Quantitative detection of pork meat by EvaGreen real-time PCR to assess the authenticity of processed meat products //Food Control. – 2017. – Т. 72. – С. 53-61

18. Sievers F., Higgins D. G. Clustal omega //Current protocols in bioinformatics. – 2014. – Т. 48. – №. 1. – С. 3.13. 1-3.13. 16.

19. Okonechnikov K. et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit // Bioinformatics. – 2012. – Т. 28. – №. 8. – С. 1166-1167.

20. https://eurofinsgenomics.eu/en/ecom/tools/pcr-primer-design/

21. Ye J. et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction //BMC bioinformatics. – 2012. – Т. 13. – №. 1. – С. 134.

22. Visel A. et al. VISTA Enhancer Browser—a database of tissue-specific human enhancers //Nucleic acids research. – 2007. – Т. 35. – №. suppl_1. – С. D88-D92.

23. Madden T. The BLAST sequence analysis tool //The NCBI Handbook [Internet]. 2nd edition. – National Center for Biotechnology Information (US), 2013.

24. Солтынская И. В. и др. Секвенирование ДНК для определения видовой принадлежности мяса //Ветеринария. – 2018. – №. 1. – С. 55-61.

25. Bejerano G. et al. Ultraconserved elements in the human genome //Science. – 2004. – Т. 304. – №. 5675. – С. 1321-1325.

26. Venkatesh B., Yap W. H. Comparative genomics using fugu: a tool for the identification of conserved vertebrate cis‐regulatory elements //Bioessays. – 2005. – Т. 27. – №. 1. – С. 100-107.

27. Pennacchio L. A. et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences //Nature. – 2006. – Т. 444. – №. 7118. – С. 499-502.

28. Stults D. M. et al. Genomic architecture and inheritance of human ribosomal RNA gene clusters //Genome research. – 2008. – Т. 18. – №. 1. – С. 13-18.

29. Leonard J. A. et al. Animal DNA in PCR reagents plagues ancient DNA research // Journal of Archaeological Science. – 2007. – Т. 34. – №. 9. – С. 1361-1366.