Оптимизация протокола сборки рекомбинантных аденоассоциированных вирусов 2 серотипа для доставки генов вируса африканской чумы свиней в клетки млекопитающих

Африканская чума свиней (АЧС) – высококонтагиозная вирусная болезнь представителей семейства Suidae, смертность в первичных очагах которой достигает 100 %. До сегодняшнего дня средства специфической профилактики АЧС не разработаны. Несмотря на то, что исследователями предложены различные методы создания кандидатных вакцин против АЧС, до сих пор актуален вопрос разработки альтернативных антигенных вариантов, обладающих низкой реактогенностью и высокой иммуногенностью. Известно, что на продукцию рекомбинантных аденоассоциированных вирусов – потенциальных средств доставки целевых генов вируса АЧС в клетки млекопитающих – влияет множество факторов, в частности, клеточная линия, система экспрессии, условия культивирования клеток после трансфекции и качество исходных плазмидных ДНК. В настоящей работе изложены результаты оптимизации протокола сборки рекомбинантных AAV2, несущих ген мажорного капсидного белка B646L вируса АЧС в качестве модельного карго. В ходе исследований установлено, что применяемый протокол позволяет достичь истинного титра вируса (2,45±0,17) × 107 вирусных частиц на мкл, при этом на долю полноценно собранных вирусных капсидов приходится до (79,3±2,3) % всех геномных копий. При оценке потенциального цитопатогенного действия рекомбинантных ААV2 на целевые клетки (SPEV, МСК свиней) было выявлено, что высокие MOI (до 10000 вирусных частиц на клетку) не приводят к увеличению доли апоптотических клеток. Подтверждена функциональность разработанной конструкции на основе ААV2: в лизатах трансдуцированных клеток обнаруживался зрелый белок p72 с молекулярной массой 73 кДа, специфически реагирующий в вестерн-блоте с гипериммунной сывороткой свиньи. Полученные нами данные в совокупности подтверждают потенциал ААV2 как инструмента доставки генов вируса АЧС в клетки свиней, что делает его многообещающей основой для конструирования кандидатных вакцин.

1. Макаров В.В. Африканская чума свиней. Российский ветеринарный журнал. 2018; 6: 15-19. DOI: 10.32416/article_5c050abbcf8d70.94861250.

2. Груздев К.Н., Закутский Н.И., Диев В.И. Африканская чума свиней: современное состояние, эпизоотология и меры борьбы (аналитический обзор). Ветеринарный врач. 2017; 5: 3-10.

3. Алипер Т. И., Забережный А. Д., Гребенникова Т. В. Африканская чума свиней в Российской Федерации. Вопросы вирусологии. 2012; S1: 127-136.

4. Макаров В.В., Барсуков Ю.И. Эпизоотический процесс африканской чумы свиней. Актуальные вопросы ветеринарной биологии. 2022; 4(56): 8-14. DOI: 10.24412/2074-5036-2022-4-8-14.

5. Колбасов Д.В. Африканская чума свиней: создание вакцины актуально. Животноводство России. 2020; 7: 29-32. DOI: 10.25701/ZZR.2020.48.46.008.

6. Ефимова М.А., Галеева А.Г., Хамидуллина А.И., Равилов Р.Х. Анализ иммунодоминантных пептидов вируса африканской чумы свиней для конструирования кандидатных вакцин. Аграрная наука. 2023; 3: 40-45. DOI: 10.32634/0869-8155-2023-368-3-40-45.

7. Ravilov R.K., Rizvanov A.A., Mingaleev D.N., Galeeva A.G., Zakirova E.Yu., Shuralev E.A., Rutland C.S., Khammadov N.I., Efimova M.A. Viral Vector Vaccines Against ASF: Problems and Prospectives. Front Vet Sci. 2022; 9: 830244. DOI: 10.3389/fvets.2022.830244.

8. Wang D., Tai P.W.L., Gao G. Adenoassociated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019; 18(5): 358-378. DOI: 10.1038/s41573-019-0012-9.

9. Усман Н.Ю., Ребриков Д.В. Рекомбинантные аденоассоциированные вирусы как средство доставки генов для использования в молекулярной медицине. Вестник РГМУ. 2021; 5: 5-11. DOI: 10.24075/vrgmu.2021.051.

10. Oziolor E.M., Kumpf S.W., Qian J., Gosink M., Sheehan M., Rubitski D.M., Newman L., Whiteley L.O., Lanz T.A. Comparing molecular and computational approaches for detecting viral integration of AAV gene therapy constructs. Mol Ther Methods Clin Dev. 2023; 29: 395-405. DOI: 10.1016/j.omtm.2023.04.009.

11. .Grieger J.C., Soltys S.M., Samulski R.J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 2016; 24(2): 287–97. DOI: 10.1038/mt.2015.187.

12. Рябова Е.И., Деркаев А.А., Есмагамбетов И.Б., Щебляков Д.В., Довгий М.А., Бырихина Д.В., Прокофьев В.В., Чемоданова И.П. Сравнение различных технологий получения рекомбинантного аденоассоциированного вируса в лабораторном масштабе. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2021; 21(4): 266–278. DOI: 10.30895/2221- 996X-2021-21-4-266-278.

13. Ravilov R., Galeeva A., Frolov G., Efimova M., Zakirova A., Rizvanov A., Hisamutdinov A., Garipov L., Mingaleev D. Efficient delivery of the immunodominant genes of African swine fever virus by adenoassociated virus serotype 2. Vet World. 2023; 12(16): 2425-2430. DOI: 10.14202/vetworld.2023.2425-2430.

14. De Villiers E.P., Gallardo C., Arias M., da Silva M., Upton C., Martin R., Bishop R.P. Phylogenomic analysis of 11 complete African swine fever virus genome sequences. Virology. 2010; 400(1):128-136. DOI: 10.1016/j.virol.2010.01.019.

15. Stender S., Murphy M., O'Brien T., Stengaard C., Ulrich-Vinther M., Søballe K., Barry F. Adeno-associated viral vector transduction of human mesenchymal stem cells. Eur Cell Mater. 2007; 13: 93-99. DOI: 10.22203/ecm.v013a10.

16. Середа А.Д., Колбасов Д.В. Белки вируса африканской чумы свиней. Научный журнал КубГАУ. 2012; 77: 21-37.