Изыскание генетических маркеров для ПЦР-РВ индикации возбудителя вирусной геморрагической септицемии рыб

Вирусная геморрагическая септицемия является одной из наиболее опасных болезней рыб, наносящих существенный урон экономическому развитию аквакультуры. В Российской Федерации диагностические мероприятия по выявлению данного возбудителя, как правило, базируются на серологических подходах. Однако, наиболее быстрыми и точными являются молекулярногенетические методы диагностики, в основе которых лежит полимеразная цепная реакция. Целью данной работы явилась разработка комбинации праймеров и зонда, пригодной для специфической ПЦР-индикации вируса геморрагической септицемии в режиме реального времени. На первом этапе работы был осуществлен биоинформационный анализ доступных, на сегодняшний день, нуклеотидных последовательностей геномов возбудителя вирусной геморрагической септицемии. Проанализировав последовательности данного вируса, в пределах гена N, кодирующего нуклеопротеин, определен маркерный локус размером 180 п.о. В пределах данного локуса разработаны праймеры и зонд, пригодные для выявления изолятов вирусной геморрагическая септицемии в формате полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. В результате серии экспериментов, проведенных на кДНК, выделенных из вирусных культур VHSV ЧФ 1.2, VHSV 22- ARM, IHNV и IPN, была определена программа амплификации и состав реакционной смеси. Установлено, что разработанные праймеры обладают 100 % специфичностью, а чувствительность может достигать 12 копий вирусных частиц на микролитр. Таким образом, подобранные в рамках данной работы нуклеотидные маркеры и сконструированные на их основе праймеры и зонд обладают всеми необходимыми характеристиками необходимыми для использования их в качестве основы тест-системы, позволяющей проводить быструю ПЦР-индикацию вируса для выявления и идентификации возбудителя вирусной геморрагическая септицемии.

1. Yusuff S., Kurath G., Kim M.S., Tesfaye T.M., Li J., McKenney D.G., Vakharia V.N. The glycoprotein, non-virion protein, and polymerase of viral hemorrhagic septicemia virus are not determinants of host-specific virulence in rainbow trout. Virol J. 2019; 16 (1):31. https://doi.org/10.1186/s12985-019-1139-3

2. Baillon L., Mérour E., Cabon J., Louboutin L., Vigouroux E, Alencar ALF, Cuenca A, Blanchard Y, Olesen NJ, Panzarin V, Morin T, Brémont M, Biacchesi S. The Viral Hemorrhagic Septicemia Virus (VHSV) Markers of Virulence in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). Front Microbiol. 2020; 11:574231. https:// doi.org/10.3389/fmicb.2020.574231.

3. Kim H.J., Cuenca A., Olesen N. J Validation of a novel one-step reverse transcription polymerase chain reaction method for detecting viral haemorrhagic septicaemia virus. Aquaculture. 2018; 492:170-183. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2018.03.047.

4. Ito T., Kurita J., Mori K., Olesen N.J. Virulence of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) genotype III in rainbow trout. Vet Res.; 47:4. https://doi.org/10.1186/s13567-015-0303-z

5. Пыльнов В. А., Бурлаченко И. В., Бычкова Л. И. Применение гнездового варианта ПЦР (ОТ-ПЦР) для диагностики вируса геморрагической септицемии у лососевых рыб. Актуальные вопросы пресноводной аквакультуры: Сборник научных трудов Филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «ВНИРО» («ВНИИПРХ»). 2023; 94:122- 129.

6. Анисимова Е.А., Додонова Е.А., Миргазов Д.А., Фахрутдинов Н.А., Елизарова И.А., Панкова Е.В., Осянин К.А. Подбор оптимальных условий постановки ПЦР для идентификации возбудителя бруцеллеза собак. Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2023; 12(230):55-59. https:// oi.org/10.53083/1996-4277-2023-230-12- 55-59.

7. Громова Е.А., Миргазов Д.А., Додонова Е.А., Елизарова И.А., Горбунова М.Е., Осянин К.А. Разработка мультиплексной ПЦР-РВ тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза. Ветеринарный врач. 2024; 3:34-40. https://doi.org/10.33632/1998-698X_2024_3_34.

8. Громова Е.А., Осянин К.А., Додонова Е.А., Горбунова М.Е., Хаммадов Н.И., Макаева А.Р. Генетические маркеры для ПЦР-индикации вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых рыб. Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. 2024; 5:88-94.

9. Chico V., Gomez N., Estepa A., Perez L. Rapid detection and quantitation of viral hemorrhagic septicemia virus in experimentally challenged rainbow trout by real-time RT-PCR. J Virol Methods. 2006; 132(1- 2):154-9. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2005.10.005

10. Warg J.V, Clement T., Cornwell E.R, Cruz A., Getchell R.G, Giray C., Goodwin A.E, Groocock G.H., Faisal M., Kim R., Merry G.E., Phelps N.B., Reising M.M., Standish I., Zhang Y., Toohey-Kurth K. Detection and surveillance of viral hemorrhagic septicemia virus using real-time RT-PCR. II. Diagnostic evaluation of two protocols. Dis Aquat Organ. 2014; 111(1):15-22. https://doi.org/10.3354/dao02758

11. Тарасова А. С., Перчун А. В., Мельников В. П. Применение полимеразной цепной реакции для выявления возбудителей некоторых особо опасных вирусных болезней рыб. Ветеринария сегодня. 2020; 1 (32):11-16. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2020-1-32-11-16

12. Перчун А. В., Воробьев В. В., Мельников В. П. Обнаружение особо опасных вирусных болезней рыб семейства лососёвых (Salmo salar) с применением полимеразной цепной реакции. Рыбное хозяйство. 2022; 5:88-93. https://doi.org/10.37663/0131-6184-2022-5-88-93