Разработка мультиплексного ПЦР-анализа в реальном времени для выявления вируса инфекционной бурсальной болезни и вируса инфекционной анемии цыплят

Инфекционная бурсальная болезнь и инфекционная анемия цыплят являются значимыми и актуальными проблемами современной отрасли птицеводства. Вирус инфекционной бурсальной болезни (ИББ) и вирус инфекционной анемии цыплят (ИАЦ) имеют широкое распространение, вызывают серьёзные поражения лимфоидных органов и тканей, в результате которых развиваются тяжёлые иммунодепрессивные состояния приводящие к повышению восприимчивости птиц к другим инфекциям, падению продуктивных показателей, снижению эффективности профилактических мероприятий и росту экономических затрат. Данные болезни в настоящее время в основном протекают в субклинической форме, по вакцинному фону, в ассоциации, сопровождаются возникновением вторичных инфекций, отсутствием характерных клинических признаков, что затрудняет проведение диагностических исследований. Мы разработали мультиплекс ПЦР-анализ в реальном времени, который позволяет одновременно детектировать оба вируса в одной пробе. Данный ПЦР -анализ основан на праймерах, которые предназначены для выявления высоко консервативных перекрывающихся областей геномов вирусов ИББ и ИАЦ, и TaqMan-зондов в качестве системы детекции. Тесты на аналитическую чувствительность при 10-кратных серийных разведениях, показали, что анализ имеет высокий коэффициент детерминации и эффективности. Анализ обладает специфичностью, отсутствием перекрёстной реактивности и неспецифической амплификации. Коэффициенты детерминации, эффективность реакции, низкая внутри- и межсерийная вариабельность сопоставимы с одиночными анализами на вирусы ИББ и ИАЦ. Мультиплексный формат позволяет существенно сократить время анализа, снизить риски возникновения контаминации, сохранив высокую чувствительность и специфичность реакции. Ожидается, что предложенный формат ПЦР-анализа обеспечит возможность быстро идентифицировать вирусы ИББ и ИАЦ, что значительно повысит эффективность диагностических исследований.

1. J. Hoerr. Clinical aspects of immunosuppression in poultry. Avian Dis. 54 (2010): 2–15. URL: https://doi.org/10.1637/8909-043009-Review.1.

2. Gimeno IM, Schat KA. Virus-Induced Immunosuppression in Chickens. Avian Dis. 2018 Sep;62(3):272-285. doi:10.1637/11841-041318-Review.1. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30339511/.

3. M. E. Dmitrieva, A. S. Dubovoi, V. A. Manuvera [et al.]. Biological properties of infectious bursal disease virus. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. 2018. Vol. 9, No. 6: 1891-1896. Режим доступа: https://elibrary.ru/item.asp?id=38674853.

4. Shirokov D. A., Manuvera V. A., Lazarev V. N. [et al.]. Complete genome sequence of a novel very virulent strain of infectious bursal disease virus circulating in Russia. Microbiology Resource Announcements. 2018. Vol. 7, No.20: е01084-18. Режим доступа: https://elibrary.ru/item.asp?id=38618595.

5. Shirokov D. A., Manuvera V. A., Lazarev V. N. [et al.]. Generation of recombinant VP3 protein of infectious bursal disease virus in three different expression systems, antigenic analysis of the obtained polypeptides and development of an ELISA test. Archives of Virology. 2020. Vol. 165, No. 7: 1611-1620. - DOI 10.1128/MRA.01084-18. Режим доступа: https://elibrary.ru/item.asp?id=43274990.

6. Lin W, Zhang Z, Xu Z. et al. The association of receptor of activated protein kinase C 1(RACK1) with infectious bursal disease virus viral protein VP5 and voltagedependent anion channel 2 (VDAC2) inhibits apoptosis and enhances viral replication. J Biol Chem. 2015. Mar 27; 290 (13): 8500-10. URL: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925820639904?via%3Dihub.

7. Rosario, M. Breitbart, B. Harrach, J. Segalés, E. Delwart, P. Biagini, A. Varsani. Revisiting the taxonomy of the family Circoviridae: establishment of the genus Cyclovirus and removal of the genus Gyrovirus. Arch. Virol. 162 (2017): 1447–1463. URL: https://link.springer.com/article/10.1007/s00705-017-3247-y.

8. Claudia Techera, Ana Marandino, Gonzalo Tomás, Sofía Grecco, Martín Hernández, Diego Hernández, Yanina Panzera & Ruben Pérez. Origin, spreading and genetic variability of chicken anaemia virus. Avian Pathology. 2021. T.50:4: 311-320. URL: https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/03079457.2021.1919289.

9. Lai GH, Lin MK, Lien YY, Cheng JH, Sun FC, Lee MS, Chen HJ, Lee MS. Characterization of the DNA binding activity of structural protein VP1 from chicken anaemia virus. BMC Vet Res. 2018. May 4. - T. 14 (1): 155. URL: https://bmcvetres.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12917-018-1465-5.

10. E. Eregae, C. E. Dewey, S. A. McEwen, R. Ouckama, D. Ojkić, M. T. Guerin. Flock prevalence of exposure to avian adenoassociated virus, chicken anemia virus, fowl adenovirus, and infectious bursal disease virus among Ontario broiler chicken flocks. Avian Dis. 2014 (58): 71–77. URL: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24758116/.

11. Абгарян, С. Р. Молекулярно-биологические методы диагностики болезней птиц / С. Р. Абгарян // Актуальные вопросы ветеринарной медицины и лабораторной диагностики : материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора В.В. Рудакова, Санкт-Петербург, 25–26 мая 2023 года. – Санкт-Петербург: Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины, 2023. – С. 3-5. – Режим доступа: https://elibrary.ru/item.asp?id=54023930.

12. Marandino, G. Tomás, M. Hernández, Y. Panzera, M.I. Craig, A. Vagnozzi, F. Vera, C. Techera, S. Grecco, A. Banda, D. Hernández, R. Pérez. Development of RT-qPCR assays for the specific identification of two major genotypes of avian infectious bronchitis virus. J. Virol. Methods. 2016. 235: 21–25. URL: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166093416300325?via%3Dihub.