Разработка мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для одновременной индикации вирусов классической чумы свиней и болезни Ауески

Особое внимание при проведении профилактических мероприятий, а также оперативных действий в случае возникновения вспышек классической чумы свиней (КЧС) и болезни Ауески (БА) следует уделять разработке и внедрению инновационных методов диагностики, что позволит своевременно выявлять и локализовать очаги инфекции. Целью данной работы являлось конструирование мультиплексной ПЦР-РВ тест-системы для диагностики классической чумы свиней и болезни Ауески. С помощью биоинформационного анализа нуклеотидных последовательностей вируса КЧС и возбудителя БА, обнаружены наиболее перспективные участки для индикации данных патогенов – размером 139 пар нуклеотидов (п.н.) расположенный в области генома вируса КЧС и 135 п.н. в области генома БА. Исходя из вариабельности нуклеотидных последовательностей выбранных регионов сконструированы олигонуклеотиды, пригодные для индикации искомых вирусов методом ПЦР-РВ в одной пробирке, используя разные каналы флуоресценции. Для каждой из созданных комбинаций олигонуклеотидов с использованием специально разработанного положительного контроля, который представляет собой генетическую конструкцию плазмидной ДНК (5827 п.н.), содержащую маркеры для обнаружения всех определяемых вирусов и образцов РНК/ДНК, полученных из биологического материала свиней, были проведены моно- и мульплексные реакции. На основании полученных результатов определена программа амплификации и оптимальный состав реакционной ПЦРРВ смеси. Установлено, что каждому биологическому патогену соответствовала индивидуальная флуоресцентная метка. Чувствительность разработанного ПЦР-РВ теста для диагностики КЧС и БА может достигать – 4 копии ДНК в реакционной смеси. При апробации способа мультиплексной ПЦР-РВ с использованием штаммов «ШиМынь» вируса КЧС и «Арский» возбудителя БА был получен следующий результат – рост сигнала флюоресценции по каналу ROX (Сt – 18.3) для КЧС и по каналу R6G (Сt – 22,6) – БА. Таким образом, нами продемонстрирована возможность проведения одновременной ПЦР для выявления геномов искомых возбудителей.

1. Хаммадов Н.И., Горбунова М.Е., Сальманова Г.Р., Фахрутдинов Н.А., Гулюкин А.М., Галеева А.Г., Громова Е.А. Конструирование специфических праймеров для ПЦР- диагностики классической чумы. Ветеринарный врач. 2024; 3:41-46. https://doi.org/ 10.33632/1998-698X_2024_3_41

2. Аноятбекова А.М., Южаков А.Г., Аноятбеков М., Алипер Т.И., Гулюкин А.М. Атипичный пестивирус свиней (Pestivirus K) — новая проблема в промышленном свиноводстве (обзор). Сельскохозяйственная Биология. 2023; 58(2):260-273. https://doi.org/10.15389/agrobiology.2023.2.260rus

3. Юсупова Г.Р. Влияние вакцины из штамма "КС" против классической чумы на иммунологические показатели свиней. Ветеринарный врач. 2008; 3:30-32.

4. Coronado L, Perera C.L., Rios L., Frías M.T., Pérez L.J. A Critical Review about Different Vaccines against Classical Swine Fever Virus and Their Repercussions in Endemic Regions. Vaccines (Basel). 2021; 15;9 (2):154. https://doi.org/10.3390/vaccines9020154

5. Галеева А.Г., Усольцев К.В., Хаммадов Н.И., Насыров Ш.М. Дизайн антигенной композиции на основе фрагмента гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней. Ветеринарный врач. 2024; 1:28-33. https://doi.org/10.33632/1998-698Х_2024_1_28

6. Галеева А.Г., Ефимова М.А., Усольцев К.В., Насыров Ш.М., Хаммадов Н.И., Ахунова А.Р., Хайруллин Р.Ф., Яруллина Г.М. Экспрессия в E. coli маркированного рекомбинантного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней. Международный вестник ветеринарии. 2024; 2:49-52. https://doi.org/10.52419/issn2072-2419.2024.2.49

7. Балышева В.И., Жестерев В.И., Лошманова Н.И., Баньковская Н.С., Слищук Т.Е. Ассоциированная вакцина против болезни Ауески и болезни Тешена. Ветеринария. 2011; 9: 26-27.

8. Оганесян А.С., Шибаев М.А., Петрова О.Н., Баскакова Н.Е., Караулов А. К. Ситуационный анализ по болезням свиней: общая оценка рисков и приоритизация эпизоотических угроз для систем биозащиты свиноводческих предприятий в Российской Федерации. Ветеринария сегодня. 2024; 13 (3):82-291. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2024-13-3-282-29

9. Чадаева А.А., Поволяева О.С., Лаптева О.Г., Луницин А.В., Юрков С.Г. Чувствительность культур клеток различного тканевого и видового происхождения к вирусу болезни Ауески. Ветеринария. 2021; 7:33-37. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2021.24.7.33-37

10. Баборенко Е. П. Изучение поствакцинального иммунитета при использовании вакцин против вируса болезни Ауески свиней из маркированного штамма. Ветеринария сегодня. 2016; 4(19):49-52.

11. Усольцев К.В., Шангараев Р.И., Хаертынов К.С., Горбунова М.Е., Хаммадов Н.И., Осянин К.А., Хамидуллина А.И. Дизайн праймеров для индикации патогенных лептоспир методом гнездовой полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2025; 2:95-106. https://doi.org/10.36871/vet.zoo.bio.202502111

12. Оганесян А.С., Шевцов А.А., Щербаков А.В., Коренной Ф.И., Караулов А.К. Классическая чума свиней: ретроспективный анализ эпизоотической ситуации в Российской Федерации (2007-2021 гг.) и прогноз на 2022 г. Ветеринария сегодня. 2022; 11(3):229-238. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2022-11-3-229-238.

13. Wang F.I., Deng M.C., Huang Y.L., Chang C.Y. Structures and Functions of Pestivirus Glycoproteins: Not Simply Surface Matters. Viruses. 2015; 29;7(7):3506-29. https://doi.org/10.3390/v7072783

14. Сизикова Т.Е., Мельникова Е.В., Маношкин А.В., Петров А.А., Мельников Д.Г., Пантюхов В.Б., Лебедев В.Н., Борисевич С.В. Использование внешних и внутренних контрольных образцов при постановке полимеразной цепной реакции и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 3:41-44.